浅谈食品中大肠菌群和菌落总数检测的几个操作规范要点
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摘要：本文介绍了食品中大肠菌群和菌落总数的检验中容易不规范操作的几个方面，并针对性地提出解决办法。
关键词：食品 大肠菌群 菌落总数 检测 规范
前言
目前，食品大肠菌群与菌落总数的检测标准主要是采用GB/T4789.3-2003食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定[1]、GB4789.3-2010食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数[2]、GB4789.2-2010食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定[3]这三个国家标准。但是目前国家标准只给出了实验的基本操作步骤及计算方法，而在实际的检验工作中，还存在一些影响操作可靠性的因素并未给出说明。本文结合笔者自身检验经验，对大肠菌群与菌落总数的检测过程中易发生不规范操作的部分做出强调，以期对每个检验环节精确控制，以获得稳定可信的检验结果。
一、大肠菌群测定的一些要点：
大肠菌群的发酵试验中要用到小倒管，主要用来观察气泡的出现。但是实验中经常会出现还未接种样液，小倒管内就出现气泡，这样会影响结果的判断。现列举出出现这种现象的几种原因及对策：
1.小倒管的口太小。在灭菌过程中，高压会将培养基压进小倒管，使空气排出，但如果小倒管开口过小，空气不容易出来，培养基也不容易进去，容易导致气泡残留在管内影响观察，若是这种情况，可以改用开口较大的V形管代替。
2.小倒管里面残留有水珠。因为小倒管开口很小，清洗后内部的水不容易干燥完全。这样会导致灭菌过程中培养基无法进去，使用时要注意放置小倒管前要将其内部的水甩干。
3.硅胶塞将试管口塞得过紧。硅胶塞将试管口塞得过紧，会使在灭菌过程中试管内外的压力不一致，灭菌锅升温升压时，锅内压力大于试管内压力，压力不够将培养基完全压进小倒管，于是就会残留气泡。塞子过紧还易导致灭菌锅降温时，锅内压力小于试管内压力，容易使试管内培养基喷出，培养基报废。解决的办法是，硅胶塞不要塞得过紧或者选用更透气的棉塞。
4.灭菌完毕后太快打开灭菌锅。当灭菌锅压力表示数为0而温度表示数还高与室温时，不要打开灭菌锅。因为打开锅盖瞬间，锅内大量热量散出，温度突然降低，试管内温度也随着降低，导致管内气压减小，沸点降低，部分培养基会汽化留在小倒管内。解决的办法是，等灭菌锅内气压和温度都降到与室温一致或相差不大时再打开灭菌锅，或者等试管冷却后放在4℃冰箱内，利用温度差，将小倒管中气泡排出。另外，灭菌完毕后过早打开灭菌锅还有可能造成培养基或者其他液体试剂喷溅出来，导致灭菌失败。
5.灭菌锅压力达不到要求。灭菌锅压力达不到标准要求，就不能强行将空气从小倒管中排出，导致气泡残留，而压力达不到，灭菌温度也相应的会降低，会导致灭菌不彻底。解决的办法是检查修理灭菌锅。
6.培养基质量也会引起小倒管中残留气泡。用装有水的试管与装有培养基的试管作对照，若装有水的试管内小倒管正常排气，则可考虑培养基中含有高温高压产气成分，导致小倒管中残留气泡。解决的办法是更换培养基。
遇到小倒管产气时要仔细分析原因，切不可将试管大角度倾斜或者颠倒排气，这样会导致试管口和试管塞污染及培养基流出。
二、菌落总数测定的一些要点：
1.稀释液的选用：国标上列出的稀释液有生理盐水和磷酸盐缓冲液两种可选用，生理盐水能维持细胞良好的渗透压，有利于菌的生长，磷酸盐缓冲液具有较强的缓冲能力，因此也可为细胞维持一个较为稳定的pH环境，避免细胞受损害。对于一般的样品可以使用生理盐水，对于偏酸偏碱的样品用磷酸盐缓冲液能防止培养基受样品酸碱影响从而引起不良的性能。
2.移液管的使用：接种时使用移液管要注意，从吸管筒内取出灭菌吸管时，不要将吸管尖端碰着其他仍留在容器内的吸管的外露部分；而且吸管在进出装有稀释液的玻璃瓶和试管时，也不要触及瓶口及试管口的外侧部分；因为这些部分都可能接触过手或其他沾污物。而接种后的废弃移液管尖端及外壁还有残留样品溶液，要立即将尖端插入装有消毒液的桶内，以防止微生物气溶胶产生，消毒液可选用0.1%的新洁尔灭溶液。
3.空白对照的接种：空白对照分为几种做法，一种是空白平板，直接加20ml的琼脂，另一种是先在平板里面加1ml灭菌后稀释液再加20ml的琼脂，这样才能检验出平板和稀释液是否灭菌彻底，直接加琼脂的是为了监测琼脂是否有污染，先加入1mL稀释液的是为了监测稀释液有没有污染。此外还有在操作台上放置琼脂平板，将一只装有培养基的培养皿盖打开，直到操作结束，为检验操作过程及环境中是否污染。还有一种是样品的空白，样品空白只针对某些接种后有颗粒状物质的样品，可以接种样品后将此平板放置于4℃冰箱内，等样品正常培养后同时取出观察，计数时作为空白对照，以区分菌落和颗粒。另外还有一种区分食品颗粒与菌落的方法是，在已熔化而保温在45℃水浴内的平板计数琼脂中，按100ml加1ml0.5%氯化三苯四氮唑（TTC）水溶液，培养后食品颗粒不变色，细菌为红色。
4.培养基的倾注：在加入样液后，应在15min内倾注培养基，这样做的原因是，若时间过长，有可能使样液干燥贴在平板上，倾注培养基后不易摇开，样液在培养基内分布不均，易产生片状菌落，不易计数。检样与培养基混匀时，可先向一个方向旋转，然后再向相反方向旋转。旋转中应防止混合物溅到皿边的上方。培养基凝固后，应尽快将平皿翻转培养，保持琼脂表面干燥，以避免菌落蔓延生长，影响计数。
5.菌落总数的计算：计算菌落总数时，如果遇到高稀释度的平板上菌落比低稀释度平板上菌落少，则说明检验过程存在失误或是样品中含有抑菌物质，这样的结果不可用于报告，应综合判断后再行检验。如果三个稀释度上菌落数都超过300，不能以多不可计作为报告，应在最高稀释度的平板上任意选取单位面积，计算菌落数，然后再乘以平板面积得出平板上的总菌落数，再乘以稀释倍数报告结果。
结束语
以上是对食品中大肠菌群和菌落总数检验中经常会遇到的几个问题和需要注意的细节的总结，食品微生物的检测要求检验人员具有良好的无菌意识，微生物检测需要长期积累，细心总结，规范操作，保证得到准确的检验结果，为食品卫生质量做出正确评价。
参考文献：
[1]GB/T4789.3-2003食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定
[2]GB4789.3-2010食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数
[3]GB4789.2-2010食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定