血管紧张素转换酶基因多态性与小儿过敏性紫癜及紫癜性肾炎的关联性

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[摘要] 目的:探讨血管紧张素转换酶(ACE)基因多态性与小儿过敏性紫癜(HSP)及紫癜性肾炎(HSPN)的相关性。方法:选择106例HSP患儿,其中HSPN患儿32例,在HSPN中单纯性血尿13例,蛋白尿19例,肾功能不全12例,肾脏活检依据ISKDC病理分级,其中Ⅰ～Ⅱ级11例,Ⅲ～Ⅵ 级17例。正常对照儿童100例。通过聚合酶链反应(PCR)检测ACE基因多态性并鉴定其基因型。结果:①HSP患儿与正常对照组间ACE基因型分布差异无统计学意义(P>0.05),但在HSPN组中,DD基因型及D等位基因频率则明显高于正常对照组(P50 mg/24 h)、明显血尿(镜检RBC>3+/HP)及非轻度肾脏病理损害(Ⅲ～Ⅵ级)组中的频率明显高于对照组(P0.05)。结论:ACE基因多态性可能与HSP的发病及其HSPN肾功能的改变无关,但可能与HSPN的发病、血尿、蛋白尿及肾脏病理损害的严重程度有关。

[关键词] 过敏性紫癜;过敏性紫癜性肾炎;血管紧张素转换酶;基因多态性

[中图分类号] R554+.6 [文献标识码]A [文章编号]1674-4721(2010)05(a)-005-4

Association between angiotensin-converting enzyme gene polymorphism and children with Henoch-Schonlein purpura and Henoch-Schonlein purpura nephritis

CUI Zhangli, SHI Yan*, YIN Huaiqing, FAN Shulan, LI Hong, YUAN Pingfei

(Department of Pediatric, the First Hospital of Shanxi Medical University, Shanxi Provicne, Taiyuan030001, China)

[Abstract] Objective: To explore the relationship between ACE gene polymorphism and the children with Henoch-Schonlein purpura (HSP) and Henoch-Schonlein purpura nephritis (HSPN). Methods: Choosing 106 cases with HSP, of which 32 cases of children were HSPN. In HSPN group, of which 13 cases were hematuria, 19 cases were proteinuria and 12 cases were renal insufficiency. Renal biopsy was based on ISKDC, of which 11 cases of gradeⅠ-Ⅱ, 17 cases of grade Ⅲ-Ⅵ. Normal control children were 100 cases. Polymerase chain reaction (PCR) was used to detect ACE gene polymorphism and identify their genotype. Results: The frequency of ACE genotypes had no significant difference between children with HSP and normal control group (P>0.05), but the frequency of DD genotype and D allele was significantly higher in children with HSPN than that of normal control group (P50 mg/24 h), grossive hematuria (microscopic RBC>3+/HP) and non-mild glomerular lesion (grade Ⅲ-Ⅵ) groups were significantly higher than that of control group (P0.05). Conclusion: ACE gene polymorphism may be not related to the occurrence of HSP and renal function change of HSPN, but it may be related to the occurrence, the severity of proteinuria, hematuria and renal pathological classification of HSPN.

[Key words] Henoch-Schonlein purpura; Henoch-Schonlein purpura nephritis; Angiotensin-converting enzyme; Gene polymorphism

过敏性紫癜(allergic purpura, AP)又称亨-舒综合征(Henoch-Schonlein purpura, HSP),是儿童时期多发的一种以小血管炎为主要病变的系统性血管炎,可以侵袭全身多个脏器[1],肾脏往往最易受累,且与HSP的病情进展及预后关系最为密切[2]。但目前有关过敏性紫癜性肾炎(Henoch-Schonlein purpura nephritis, HSPN)的病因及其发病机制仍不明确,近年来随着基因多态性在各个研究领域的深入,国内外已有一些研究成果表明血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)基因多态性可能与HSPN的发病及其肾脏病理损害密切相关[3],然而另有一些研究结果与其相悖[4],认为ACE基因多态性可能与HSPN的发病及其病理进展无明显相关性,对此目前尚未形成统一定论,故探讨ACE基因多态性与HSP及HSPN是否具有相关性仍是人们关注的焦点。本文旨在对我国山西省汉族106例HSP、HSPN患儿及100例正常儿童进行ACE基因多态性检测,并结合HSP及HSPN的临床特征及其实验室检查结果,分析ACE基因多态性在HSP及HSPN各组间的分布,进一步探讨ACE基因多态性与我国山西省汉族儿童HSP及HSPN的相关性。

1资料与方法

1.1 一般资料

患病组:所有患者均来自2006年12月～2009年12月在本院儿科住院的HSP及HSPN患儿,共106例,男68例,女38例,年龄4～14岁,平均(8.2±1.9)岁。HSP诊断符合1990年由美国风湿病协会制定的诊断标准[5],HSPN临床及病理诊断依据2000年11月由我国小儿肾脏病学组在珠海会议上制定的诊断标准[6]。正常对照组:均来自本院健康体检的儿童,共100例,男63例,女37例,平均年龄(8.0±1.6)岁,肝、肾功能正常。所有受试对象均为无血缘关系的山西省汉族儿童,经详细询问病史,体格检查及实验室检查后,均除外IgA肾病、血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病史及其他风湿性疾病病史,两组研究对象年龄、性别构成比差异无统计学意义(P>0.05)。

收集HSPN患儿血尿、蛋白尿及肾功能等临床资料,肾脏病理损伤采用ISKDC进行分级[7],分为6级:Ⅰ级,轻微肾小球异常;Ⅱ级,单纯系膜增生;Ⅲ级,轻微肾小球异常或系膜增生伴

1.2 ACE基因多态性检测

1.2.1 外周血基因组DNA的提取抽取外周新鲜静脉血3～5 ml(10%草酸钾0.1 ml抗凝),采用经典Miller蛋白酶-K氯化钠盐析法从HSP、HSPN患儿及正常对照者外周血中提取基因组DNA[8]。

1.2.2 合成ACE基因引物针对ACE基因第16内含子处存在一287 bp片段的插入(insertion, I)/缺失(desertion, D)多态性,综合国内外多篇参考文献,参考Rigar B等[9]设计的PCR引物,委托北京奥科生物技术有限责任公司合成。引物序列为:正引物,5'-CTGGAGACCACTCCCACTCTTTCT-3',反引物,5'-GATGATGTGGCCATTCGTCAGAT-3'。

1.2.3 ACE基因多态性检测用PCR方法PCR反应体系25 μl,其中10×buffer 2.5 μl,25 mmol MgCl2 1.5 μl,2.5 mmol/L dNTP 2 μl,5 pmol/μl 正反引物各2 μl,2.5 U/μl Taq DNA聚合酶1.25 U(TIANGEN 公司),基因组DNA1.0 μg,加去离子水至25 μl。PCR反应条件为:94℃预变性4 min,94℃变性60 s,58℃退火60 s,72℃延伸60 s,共30个循环,72℃延伸10 min,在PTC-100热循环仪上完成循环。取PCR产物3 μl,在1.5%琼脂糖凝胶上电泳,溴化乙锭染色,在GIS凝胶图像处理系统中观察PCR产物是否存在及其片段大小。

1.3统计学方法

采用SPSS 12.0统计软件包进行统计学分析,计量资料采用均数±标准差,通过直接计数法计算出HSP、HSPN及正常对照组间ACE基因型及其等位基因频率,经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验,各组间构成比差异采用χ2检验或Fisher精确检验,以P

2结果

2.1 ACE基因的PCR产物

依据ACE基因所设计的序列引物经PCR反应扩增后可得到2条清晰的条带,即插入片段(I)的490 bp和缺失片段(D)的190 bp,经1.5%的琼脂糖凝胶电泳后,若仅显示1条190 bp大小的片段为缺失型(DD基因型),若仅显示1条490 bp大小的片段为插入型(II基因型),若2条带均出现则为杂合型(DI基因型),如图1所示。

2.2 HSP、HSPN组与正常对照组间ACE基因多态性分布

ACE基因型及其等位基因频率在HSP、HSPN及正常对照组中的分布详见表1、2。经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验,ACE基因频率在HSP、HSPN及正常对照组中符合遗传平衡,表明各基因频率均已达到遗传平衡,具有群体代表性,结果显示ACE 3种基因型(DD、DI和II)及其等位基因(D和I)频率在3组间比较差异有显著性(P0.016 7),但在HSPN组中,DD基因型及D等位基因频率则较正常对照组明显增高,差异有统计学意义(P

2.3 ACE基因多态性与HSPN重要临床表现及其病理分型的相关性分析

依据HSPN患儿ACE基因型的不同,比较ACE不同基因型与HSPN血尿、蛋白尿、肾功能及肾脏病理损害之间的相关性,详见表3。结果显示DD基因型及D等位基因在表现有大量镜下血尿及大量蛋白尿组中的频率分布明显增高,差异有统计学意义(P1.5 mg/dl)中,ACE 3种基因型及其等位基因频率分布则无显著性差异(P>0.05);DD基因型频率在非轻度肾脏病理损害(Ⅲ～Ⅵ级)组中的频率明显高于轻度肾小球病变组(Ⅰ～Ⅱ级),差异有统计学意义(P

3 讨论

3.1 ACE的重要生理功能

近年来肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)在肾损伤及慢性肾功能不全中的作用日益受到人们的关注,ACE为RAS中的一个重要环节,具有重要的生理功能,首先它是一种很强的血管活性因子,可参与肾小球内血流动力学的改变,改变肾小球毛细血管通透性;此外它还是一种很强的促细胞分裂因子,可刺激肾脏固有细胞的增生及转化生长因子(transforming growth factor, TGF)的合成,促使肾小球硬化及间质纤维化的形成,在肾脏疾病的发生、发展中发挥着重要作用[10-11],且有研究报道ACE基因多态性可能与血清ACE的活性密切相关,在II、DI及DD3种不同的基因型中,ACE活性呈递增趋势,II

3.2 ACE基因多态性与HSP及HSPN关系的研究现状及意义

近年来随着分子生物学技术的成熟和深入,国内外有关ACE基因多态性与HSP及其HSPN相关性的研究不乏报道,但研究结果不尽一致。Yoshioka T等[12]对HSPN及IgAN患儿研究发现,ACE基因中 DD基因型发生中、重度持续性蛋白尿的概率明显高于DI及II基因型患者。Zhou J等[3]也证实了相同的结论,且还发现DI基因型者更易发生肾功能不全,在随访中发现,II型在合并有肾脏并发症的HSP患儿中完全缓解率明显升高。Asano T等[13]报道,ACE基因多态性还可能与HSPN的肾脏病理损害密切相关,认为DD基因型者发生中度至弥漫性的肾系膜增生,肾小球硬化以及肾小管间质损伤比DI及II型明显增高。然而也有一些研究结果与其相悖,Dudley J等[4]则研究发现ACE基因多态性可能与HSPN患儿的发生无明显相关性。本研究通过对106例HSP,32例HSPN患儿及100例正常儿童进行ACE基因多态性检测,结果发现在HSPN组中DD基因型及D等位基因频率分布较正常对照组明显增高,差异均有统计学意义(P0.05),提示DD基因型及D等位基因可能为HSPN发病的遗传易感基因,而非HSP的遗传易感基因,这与Dudley J等[4]的研究结果相悖,究其原因可能与种族遗传背景、研究样本量、病例选择的标准不同及复杂的环境等因素有关,此外还有许多不明确的因素需要在今后的研究中加以考虑,以便得出更客观的评价。本研究进一步收集HSPN患儿血尿、蛋白尿、肾功能及肾脏病理等重要资料,将其进行分组,比较各组间ACE基因型的分布,结果发现在HSPN组中 DD基因型及D等位基因在表现有大量蛋白尿(尿蛋白>50 mg/24 h)及明显血尿(镜检RBC>3+/HP)组中的频率分布明显高于少量蛋白尿(尿蛋白

3.3 小结

由于本实验仅观察到了ACE基因多态性与HSP及HSPN病程初期的临床表现之间的相关性,并未对其进行随访,故关于ACE基因多态性对HSP及HSPN的病情进展及远期预后的影响,尚需进一步研究证实。此外由于HSP及HSPN的发生绝大多数是由多种致病因素共同参与所致,ACE基因多态性仅作为其中的一种致病因素,只可能在一定程度上或很大程度上与HSP及HSPN的发生、发展有关,种族遗传背景、研究样本量、病例选择的标准不同及复杂的环境等因素都会对分析ACE基因多态性与HSP及HSPN的相关性带来一定影响,这些问题均需要在今后的研究中进一步考虑。ACE基因多态性的研究在一定程度为人们从基因水平上认识HSP及HSPN发生、发展提供了重要的分子基础,也为今后临床上从基因水平认识HSP及HSPN疾病的本质及开发新的研究和新的治疗方案提供了重要的线索。

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(收稿日期:2010-03-29)