金霉素生产菌高速电子流诱变育种与发酵研究

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇金霉素生产菌高速电子流诱变育种与发酵研究范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

金霉素属四环素类药物,主要抑制敏感微生物的蛋白质合成,其抗菌谱广,对革兰阳性菌、阴性菌、螺旋体、立克次氏体、支原体、衣原体、部分原虫等均可抑制。 金霉素主要与微生物的30S小亚基A位结合,进而干扰氨基酰tRNA与30S小亚基结合,使氨基酰tRNA不能进入mRNA上的受位,抑制了蛋白质合成时肽链的延长;金霉素还可以阻止已合成的蛋白质肽链释放[1]。金霉素对70S白体的作用更为敏感,因此,金霉素能够选择性抑制敏感微生物,具有一定的安全性能。在全球范围内,金霉素是所有饲料药物添加剂中的使用量最大的品种,是国际上重要的兽用抗生素之一。

金色链霉菌(streptomycesaureofaciens)是金霉素的产生菌,是杜加尔(Duggar)于1948年筛选得到的,其发酵单位只有165U/mL[2].19世纪50年代后,我国实现了金霉素的工业生产。高能电子流能诱发DNA点突变和染色体畸变,得到了成功应用[3]。本文通过高能电子流辐射处理金霉素工业产生菌,选育出高产、遗传稳定的菌株,并对发酵工艺进行了研究,以期摸索规律指导工业生产。

1、材料和方法

1.1菌株 出发菌株金色链霉菌(streptomycesaureofaciens)工业生产菌株JH-02由金河生物科技股份有限公司保存提供。

1.2 培养基及培养条件

1.2.1 平板培养基(%)

小麦粉 2.0,硫酸镁0.005,磷酸二氢钾0.01,磷酸氢二铵0.015,琼脂2.0。120℃实消30分钟。在温度32℃±0.5℃、相对湿度40-60%条件下培养4-5天。

1.2.2斜面培养基(%)

麸皮 3.2,硫酸镁0.005,磷酸二氢钾0.01,磷酸氢二铵0.015,琼脂2.0,PH 7.4―7.6。120℃实消30分钟。在温度32℃±0.5℃、相对湿度40-60%条件下培养4天。

1.2.3种子培养基(%)

玉米淀粉4.0,黄豆粉2.0,蛋白粉0.5,酵母粉0.5,碳酸钙0.4,硫酸铵0.3,氯化钠0.2,硫酸镁0.025,磷酸二氢钾0.025,培养基装量25ml/250ml三角瓶,120℃实消30分钟。在温度30℃±0.5℃下培养22―26小时。

1.2.4发酵培养基(%)

玉米淀粉10,花生粉1.5,黄豆粉2.5,淀粉酶0.004,氯化钠0.25,硫酸铵0.5,碳酸钙0.7,蛋白粉1.4,酵母粉0.2,硫酸镁0.025,豆油1.25ml/25ml,培养基装量25ml/250ml三角瓶,120℃实消30分钟。在温度30℃±0.5℃条件下培养5天。

1.3高能电子流诱变

高能电子流发射器为BF-5电子直线加速器(E=5MeV,I=100uA),由北京师范大学低能核物理研究所提供。培养4天的新鲜斜面用15ml0.2%的葡萄糖液洗脱成熟孢子,倒入玻璃大试管中32℃振摇3小时。振摇结束后加100 ml无菌盐水制成单孢子悬浮液(>108个/ml),分装5ml于玻璃管中。低温状态下送到北京师范大学低能核物理所用高能电子流进行诱变。

每剂量组9瓶:

A组:束流2×10-7A

吸收剂量10GY/S从5秒-90秒共9个照射时间梯度

B组:束流3×10-7A

吸收剂量15GY/S从5秒-90秒共9个照射时间梯度

辐射后立即稀释涂平板。

1.4 50L发酵罐放大实验

将复筛得到的高产菌株与出发菌株JH-02分别接种于斜面培养基,34℃,培养4～5天。从成熟的斜面上刮取孢子,接种到5L种子罐培养基中,32℃,150r/min,培养24小时。以10%的接种量将种子培养液转接于50L发酵罐中,32℃,280r/min,培养120小时。

1.5发酵效价测定

化学测定法。利用金霉素在酸性溶液中经加热后能脱去一分子水,生成黄色的脱水金霉素,其色度与含量成正比。此性质符合郎伯-比耳定律,故利用比色法来测定其效价。

发酵液经草酸酸化过滤后,吸1ml滤液于9ml蒸馏水中,分别吸取1ml稀释滤液于2只50ml装有5ml 2mol盐酸的容量瓶中,一只用作CK,另一只于沸水煮沸5分钟,冷却后加水定容至刻度,摇匀后于721―B型分光光度计、波长440nm、光程1cm测定。

1.6 菌体浓度的测定

采用离心法测定。先测离心管的重量W0,然后取10ml发酵液加入离心管,测定总质量W1,离心(2000r/min×3min),弃上清,测定沉淀物及管总质量W2。根据公式计算菌体浓度。

菌体浓度=

1.7 总糖含量的测定:

见文献[4]。

1.8 菌体粘度的测定:

玻璃毛细管粘度计测定[5]。

2、结果分析

2.1高能电子流对菌株孢子的致死效应

将处理好的孢子液,稀释成一定的梯度浓度,涂布在分离平板上,在温度32℃±0.5℃、相对湿度40-60%条件下培养2-3天,计算诱变死亡率。由表1可以看出,JH-02对于高能电子流辐射表现出高度的敏感性,致死率与辐射剂量、辐射时间成正比。

2.2摇瓶筛选结果

出发菌株JH-02经高能电子流处理后,初筛得到35株新菌株,进一步复筛得到1株金霉素产量明显提高的菌株:D-23。将D-23菌株连续传5代(表1)。菌株D-23产素能力平均为21145u/ml,与JH-02发酵单位(u/ml)相比提高了13.1%。

2.3放大实验中新菌株与原始菌株生理生化特性的比较

将高产菌株D-23与出发菌株JH-02分别在50L发酵罐中进行放大实验,对发酵过程中两菌株的物理、生物、化学等参数进行比较,结果如下。

2.3.1 生长特性的比较:

:JH-02菌体浓度,■:D-23菌体浓度,

:JH-02发酵液粘度, :D-23发酵液粘度

图1JH-02与D-23菌体浓度及发酵液粘度的比较

Fig.1 Constract of the Mycelium Concentration and the Viscidity between JH-02 and D-23

在发酵过程中,D-23的菌体浓度比JH-02高5～10%。发酵中后期,JH02的粘度迅速降至2s,而D-23仍可保持较高粘度,表明其菌体仍保持一定活力(见图1)。

:JH-02 ■:D-23

图2JH-02与D-23溶解氧的比较

Fig.2 Constract of DO between JH-02 and D-23

在发酵过程中,特别是在产素集中的中期发酵过程中,D-23的DO明显低于JH-02,表明其需氧增强,菌体代谢的活力明显高于JH-02。

2.3.2 发酵过程曲线的比较:

在发酵前期,D-23与出发菌株的糖代谢速率基本一致,产物合成速率也基本一致;发酵中期,与出发菌株相比,D-23菌株活力较强,底物消耗速率略高于出发菌株,产物合成速率也明显高于出发菌株(见图3)。发酵结束时,出发菌株JH-02的金霉素产量为18905u/ml,D-23为21060u/ml,比出发菌株高11.4%。

:JH-02糖代谢率,■:D-23糖代谢率,

:JH-02产物合成速率, :D-23产物合成速率

图3 JH-02与D-23发酵过程曲线的比较

Fig.4 Constract of the Fermentation Curve between JH-02and D-23

通过以上实验验证,结果标明高能离子流处理的突变菌株D-23的稳定性和产素能力都明显优于出发菌株JH-02。

3、分析讨论

近年来,出现了一些新型的诱变方法用于微生物的诱变育种,如微波、红外射线、激光、高能电子流、离子注入等,诱变生物学效应比较明显。由于金色链霉菌代谢复杂,DNA链结合紧密,所以用常规的处理方法及诱变剂效果不太明显。高能电子流是具有相当能量的粒子流,带有负电荷,它射入生物体时,可以直接使遗传物质电离,引起DNA互补链的氢键破裂,也能引起DNA双链和单链的断裂,在微生物自身修复机制的作用下,会引起微生物DNA点突变和染色体畸变[6]。由于金霉素产生菌株对高能电子流比较敏感,致死率与剂量和照射时间成正比,故而为了得到大量的诱变体,用于照射的孢子液应该有较高的浓度,同时在比较合适的剂量下,照射时间在30-60秒得到的诱变体数量较为合适。实验证明高能电子流照射金霉素生产菌株是一种行之有效的诱变方法。

半个世纪以来,我国已经成为世界上最大的金霉素生产国,拥有3个规模较大的生产厂家.截至2005年,金霉素发酵单位产量为23000 U/mL,但距离国外最高发酵单位30000 U/mL还有很大差距.经过多年传统方法的菌种,金霉素的发酵水平一直没有大的突破[7]。筛选得到的高产菌株D-23比出发工业生产菌株JH-02的摇瓶效价提高13.1%,并且传代稳定,发酵过程代谢能力增强,产素能力提高,工厂生产已经推广。金色链霉菌通过高能电子流照射实现DNA的断裂和重组,虽然其产素能力有所提高,但是DNA断裂和重组位点不明确,其真正的代谢调控机制还是一个空白。此外,是否能够通过基因工程的方法实现金色链霉菌DNA的重组都是我们值得进一步研究的课题。

生物发酵工业,工厂规模化生产过程中,淀粉单耗一直是一个重要的经济指标,控制生产菌的代谢,加大糖代谢,减少残糖含量一直困扰着成本指标。D-23以期优异的糖代谢水平初步解决了残糖的控制。由于其发酵中后期较高的糖代谢率,使补料消耗比较充分,比较明显的降低了单耗指标。