急性移植肾排斥反应类固醇冲击治疗后淋巴细胞凋亡的作用

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作者：张波 王禾 张绍增 武国军 李欣 杨晓剑 于磊 张更

【关键词】 肾移植

Study on apoptosis of tubular epithelial cells and lymphocyte in acute rejection of renal allograft after steroid pulse therapy

【Abstract】 AIM: To explore the changes of apoptosis of tubular epithelial cells and lymphocyte in acute rejection of renal allograft after steroid pulse therapy. METHODS: Renal biopsy specimens of 64 transplant recipients with acute rejection were examined for apoptosis. Biopsies were performed after steroid pulse therapy and were compared with 40 transplant biopsies with unspecific organ injury of lymphocyte infiltration. Apoptosis cells of grafts were monitored by terminal deoxynucleotidyltransferasemediated dUTPdigoxigenin nick end labeling (TUNEL) analysis. RESULTS: The TUNEL showed that in the 64 cases of the acute rejection group, apoptosis of lymphocytes was found in 44 cases, that of tubular epithelial cells in 34 cases and no apoptosis in 20 cases. In the 40 cases of the control group, 24 biopsies showed tubular epithelial apoptosis (P＝0.2351) and 4 cases showed lymphocyte apoptosis (P＝0.000). According to the Banff classification, 16 cases were gradeⅠof acute rejection, 34 grade Ⅱand 14 grade Ⅲ. lymphocyte apoptosis were found in 14 cases, 22cases and 8 cases, respectively (P=0.1530). CONCLUSION: In the acute rejection of renal allograft after steroid pulse therapy, lymphocyte apoptosis is a phenomenon predominantly restricted to rejection processes, which may be related to the prognosis of acute rejection.

【Keywords】 renal transplantation; acute rejection；apoptosis

【摘要】 目的: 探讨在初始类固醇冲击治疗后急性肾移植排斥反应中浸润淋巴细胞的凋亡情况. 方法: 64例发生急性细胞性排斥反应的患者的肾活检标本，活检均于类固醇冲击治疗后3 d进行. 检测活检标本的细胞凋亡并与40例有淋巴细胞浸润的非特异肾损伤标本进行比较. 采用原位末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡. 结果: 在急性排斥组（n=64）中有44例患者标本中观察到淋巴细胞凋亡，34例中观察到肾小管上皮细胞凋亡，20例中未检测到细胞凋亡. 对照组（n=40）中有24例检测到肾小管上皮细胞凋亡(P＝0.2351)，淋巴细胞凋亡在4例患者中发现(P＝0.000). 根据Banff分类Ⅰ级排斥反应为16例，Ⅱ级为34例，Ⅲ级为14例，检测到淋巴细胞凋亡分别为：14例，22例和8例(P=0.1530). 结论: 在初始类固醇冲击治疗后急性肾移植排斥反应中浸润淋巴细胞凋亡是重要的，可能与排斥反应的转归有关.

【关键词】 肾移植；急性排斥反应；凋亡

0引言

为了探讨同种异体肾移植急性排斥反应(acute rejection, AR)类固醇冲击治疗后细胞凋亡的变化，我们采用原位末端标记法（TUNEL）对患者的移植肾穿刺活检标本中肾小管上皮细胞及浸润淋巴细胞凋亡进行了检测.

1对象和方法

1.1对象试验组为接受尸体肾移植64（男42，女22）例患者，平均年龄34岁. 供者年龄平均26岁. 供受者ABO血型相同，淋巴细胞毒交叉配合试验小于0.10，群体反应抗体（PRA）阴性. 移植后常规采用环孢素A+霉酚酸酯+泼尼松治疗. 急性排斥反应发生于移植后1～6 mo. 急性排斥反应发生前血Cr为(118±17) μmol・L-1，发生中为(411±192) μmol・L-1. 发生急性排斥后连续3 d用甲基强地松龙（第1日500 mg，第2，3日分别为250 mg）冲击治疗. 在冲击治疗后第3日于B超或CT介导下用Menghini或Trucut穿刺针进行移植肾穿刺活检. 对照组选取有淋巴细胞浸润的非排斥反应的移植肾活检标本40(男26，女14)例，平均年龄35岁.

1.2试剂原位细胞凋亡检测试剂盒（in situ cell apoptosis detection kit I，POD），购自武汉博士德公司，地高辛标记的三磷酸脱氧尿苷（DIGDUTP），德国Bochringer Mannheim公司；末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT），美国Promega公司；蛋白酶K、生物素标记的抗地高辛抗体（AntiDIGBiotin），美国Sigma公司.

1.3方法

1.3.1急性排斥的临床诊断标准① 患者有发热、头昏、倦怠、血压升高、食欲减退、腹胀、并排除明显肺部感染、上呼吸道感染、尿路感染等并发症. ② 移植肾肿大和疼痛. 有局部压痛、质地变硬、体积增大，并排除腹水压迫致移植肾疼痛或输尿管梗阻. ③ 移植肾功能减退. 表现为尿量减少，水、钠潴留，体质量迅速增加，血压升高，血Cr迅速上升,超过原来值的25%，并排除CsA肾毒性.

1.3.2标本制备活检标本用升汞甲醛液固定10 min后，然后放入Db液中固定. 常规石蜡包埋，切片. 各例切片做常规苏木素伊红（HE）和PAS染色，显微镜观察，进行病理诊断.

1.3.3实验步骤和判断标准移植肾活检标本石蜡切片常规脱蜡至水体积分数为3 mL・L-1新鲜H2O2处理、蒸馏水洗涤；加Tris缓冲液（TBS）1∶100新鲜稀释蛋白酶K，37℃，10 min，蒸馏水洗；加含TdT和DIGdUTP的标记缓冲液20 μL，37℃，2 h，TBS洗涤；加封闭液50 μL，室温30 min，甩干；加封闭液1∶100稀释的抗地高辛抗体55 μL，37℃，30 min，TBS洗涤；加TBS 1∶100稀释的链霉亲合素生物素过氧化酶复合物（SABC），37℃，30 min，TBS洗涤；DAB显色20 min，蒸馏水洗，苏木素复染，TBS洗；脱水，透明，封片. 显微镜观察，细胞核中有棕黄色颗粒者为凋亡细胞. 计算移植肾中10个肾小球1000个细胞中发生凋亡的浸润淋巴细胞或肾小管上皮细胞为5～10时用“+”表示，10～20个时为“”，>20个时为“”.

统计学处理：应用SPLM软件进行数据分析, 统计方法为Willcoxon秩和检验和χ2检验，P<0.05为差异有显著意义.

2结果

2.1急性排斥反应组与对照组凋亡细胞分布情况在急性排斥反应组中44例病例观察到淋巴细胞，34例患者观察到肾小管上皮细胞凋亡，20例未检测到细胞凋亡，而对照组淋巴细胞发生凋亡为4例(P=0.000) ,肾小管上皮细胞凋亡为 16例(P＝0.2351). 说明在急性排斥反应类固醇冲击治疗后与非急性排斥反应患者移植肾中,淋巴细胞凋亡差异具有显著意义,而肾小管上皮细胞凋亡差异不显著(Tab 1).

表1浸润淋巴细胞和肾小管上皮细胞凋亡检测结果　(略)

2.2Banff分类与淋巴细胞凋亡分布的关系根据Banff分类，急性排斥组中，Ⅰ级排斥反应为16例，Ⅱ级为34例，Ⅲ级为14例，检测到淋巴细胞凋亡分别为：14例(87.5%)，22例(64.7%),8例(57.1%). 急性排斥反应的严重程度与淋巴细胞凋亡无关(P=0.1530).

3讨论

器官移植后急性排斥反应中存在着细胞凋亡机制［1-3］. 同种异体移植物排斥时有大量的淋巴细胞浸润，淋巴细胞的细胞毒活性是造成移植器官损伤的主要因素［4-7］. 淋巴细胞(细胞毒T淋巴细胞)不但参与了自身的凋亡,而且参与了包括肾小管细胞在内的其他细胞的凋亡. 肾小管上皮细胞又因肾小管尤其是近曲小管上皮增殖能力较强，对缺血、缺氧等特别敏感，容易受某些损伤因素的影响而凋亡. 肾小管上皮细胞凋亡现象普遍存在,不但在移植肾急性排斥反应中可见到肾小管上皮细胞凋亡，而且在环孢素A（CsA）肾中毒及慢性排斥反应中亦可见到,肾小管细胞凋亡对于急性排斥反应不具有特征性，只是器官损伤的一种反映［3,8,9］.

以前的研究认为，在移植物排斥反应中出现的细胞凋亡是基础免疫抑制引起的［8］，却没有考虑类固醇冲击后可引起细胞程序性死亡这个诱导凋亡的途径,而浸润淋巴细胞对糖皮激素、免疫抑制剂等这些细胞凋亡诱导剂特别敏感. 本研究表明，在类固醇冲击治疗后急性移植肾排斥反应中的淋巴细胞凋亡较非急性排斥反应者差异有非常显著意义,说明淋巴细胞凋亡是局限于急性排斥反应中的主要现象.

August等［10］的研究发现在急性排斥反应中淋巴细胞凋亡发生率高的患者较低的患者预后好. 新近的体外实验研究发现凋亡细胞可积极地调节免疫应答，主动抑制T细胞活化,对免疫系统具有免疫抑制作用［10-13］,因此, 淋巴细胞凋亡在急性排斥反应中的作用具有二个方面,一是浸润的淋巴细胞程序性死亡使组织损害减轻,二是由于其免疫抑制作用,在局部形成免疫抑制的微环境,主动调节细胞因子的分泌方式,使免疫细胞分泌的细胞因子由TH1向TH2转化,从而抑制急性排斥反应的发展. 所以，在急性排斥反应组织中淋巴细胞凋亡具有重要意义，排斥反应的逆转与淋巴细胞凋亡可能有关.

移植肾穿刺活检是急性排斥反应诊断的金标准［14，15］，细胞凋亡的检测进一步加深了对病情的认识，根据Banff分类法将急性排斥反应分为轻、中、重3级，以探讨其与淋巴细胞凋亡之关系，结果表明，急性排斥反应的严重程度与移植物浸润淋巴细胞之间无相关性，这与我们应用定量竞争RTPCR的方法通过构建基因特异性竞争DNA模板，检测急性排斥反应患者尿中穿孔素及粒酶B mRNA水平的结果相一致. 总之，研究类固醇冲击治疗后急性移植肾排斥反应中的淋巴细胞凋亡较肾小管上皮细胞凋亡更具有重要意义，对其深入研究，有利于揭示急性排斥反应的机制及有可能寻求一种使肾移植物中同种异体抗原激活的淋巴细胞通过凋亡机制予以清除而移植物细胞免于凋亡的途径.

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