冰片促进葛根素和梓醇口服吸收入脑的研究

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[摘要]从细胞水平和动物水平考察冰片对葛根素和梓醇口服吸收及穿透血脑屏障入脑的影响，筛选适合梓葛复方口服制剂的冰片浓度。采用原代大鼠脑微血管内皮细胞和星型胶质细胞共培养建立体外血脑屏障模型，利用此模型研究62.5～100 mg・L-1冰片对葛根素、梓醇转运的影响。小鼠分别灌胃给予0，2.5，50，100 mg・kg-1冰片溶液后再立即灌胃给予葛根素（200 mg・kg-1）、梓醇（4.5 mg・kg-1）纳米晶混悬液，比较葛根素、梓醇在血浆和脑组织中的药动学参数。脑微血管内皮细胞和星型胶质细胞共培养7 d后，屏障功能基本形成。与未加入冰片组相比，冰片质量浓度为1.2.5～100 mg・L-1时，葛根素、梓醇跨血脑屏障模型的渗透系数显著增大（P

[关键词]冰片； 葛根素； 梓醇； 血脑屏障； 口服

血脑屏障（blood brain barrier，BBB）是存在于血液系统与脑组织之间的屏障系统。它的存在有利于维持脑内环境的相对稳定，但同时也阻碍了约98% 的小分子药物和几乎100% 的大分子药物向脑内的递送，成为脑部疾病诊断和治疗的主要阻碍。如何克服BBB，将药物有效的递送至脑内，成为脑部疾病药物治疗的关键和研究热点。

冰片是从龙脑香科植物龙脑香的树脂和挥发油中获得的结晶。《本草纲目》谓其可“通诸窍，散郁火”。历代医家都认为冰片“有引药上行，佐使之功”[1] 。现代研究证实，冰片能调节血脑屏障通透性，促进丹参酮[2]，栀子苷[34]，山柰酚[5]等药物透过血脑屏障；此外，冰片还能促进药物透过胃肠道上皮细胞，增加难溶性药物的口服吸收[6]。

葛根素是从豆科植物野葛Pueraria lobata（Wrilld）Ohwi中提取的一种水难溶性黄酮类化合物，梓醇是从玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch中提取的一种强水溶性环烯醚萜类化合物。课题组已研究证实，葛根素与梓醇配伍可改善神经功能症状、促脑血管和神经元再生，对缺血性脑卒中有良好治疗效果[710]。但葛根素的脑靶向指数约为50%[11]，梓醇的脑靶向指数约为1.3%[1.2.1.3]，入脑浓度低，使其临床应用受到较大限制。

本研究分别从细胞水平和动物水平研究冰片对葛根素、梓醇口服吸收入脑的促进作用，并筛选适合梓葛复方口服制剂的较佳浓度，以期为将葛根素、梓醇开发成治疗缺血性脑卒中的口服中药新药奠定实验基础。

1材料

AB 1.3.5S天平（梅特勒・托利多仪器有限公司）；Milieell细胞电阻仪（美国MilliERS2Millipore公司）；荧光酶标仪（美国Gene5有限公司）；LC20A高效液相色谱仪（日本岛津公司）；API 4000质谱仪（AB SCIEX有限公司）；F6/106G超细匀浆器[弗鲁克（上海）流体机械制造有限公司]；TG1.6WS高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；DZF6050真空干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）。

葛根素（纯度>98%，四川玉鑫药业有限公司，批号1.40602）；对羟基苯甲醛（纯度>98%，上海源叶生物科技有限公司，批号YY91.2.50）；梓醇（纯度>98%，石家庄流波白鸟生物科技有限公司，批号1.10808200508）；桃叶珊瑚苷（纯度>90%，潮州市泽润制药有限公司，批号20101.11.2）；荧光素钠（纯度>99%，上海源叶生物科技有限公司，批号YY1.1.3.902.5g）；甲醇、乙腈（色谱纯，Fisher公司）；其余试剂均为分析纯；冰片购自和平药房，经齐红艺教授鉴定，符合《中国药典》要求。

雌雄KM小鼠，清洁级，购于重庆市中药研究院实验动物研究所，生产许可证号SCXD（渝）201.30006，实验动物质量合格证号No0003.788。

2方法

2.1血脑屏障模型的建立

2.1.1细胞共培养模型的建立脑微血管内皮细胞（BMECs）的培养与种植参照文献[14]，从新生2周的乳鼠获取原代脑微血管内皮细胞，于3.7 ℃、5% CO2培养箱中培养。取细胞融合度为80%～90%的BMECs，消化，收集细胞并调整密度至5×105个/mL，种植于细胞培养池内，1 mL/孔。

星型胶质细胞（AS）的培养与种植：参照文献[14]，从新生3 d左右的乳鼠获取原代星型胶质细胞，于3.7 ℃、5% CO2培养箱中培养。取细胞融合度为80%～90%的AS，消化，收集细胞并调整密度至5×105/mL，种植于Transwell池的背侧，1 mL/孔。

2.1.2血脑屏障模型的鉴定

2.1.2.1跨内皮细胞电阻值的测定将培养板取出，DHanks室温平衡30 min，测定跨内皮细胞电阻值TEEREc+filter，同时以无接种细胞的培养池作为对照，测定滤层的电阻值TEERfilter。单层内皮细胞的电阻值TEEREc=（TEEREc+filter-TEERfilter）×S（膜面积S=4.67 cm2）。

2.1.2.2荧光素钠透过性分别测定质量浓度为004.3 2.4，04.3.2 4，4.3.2.4，4.3.2.4，4.3.2.4 mg・L-1的荧光素钠对照品溶液在激发波长4.20 nm和发射波长5.4.5 nm处的荧光强度，绘制成荧光素钠的荧光强度对浓度作标准曲线。在接受池中加入2 mL DEMEF1.2液，在供体池中加入1 mL DEMEF1.2液，于3.7 ℃预孵育30 min后将供体池的DEMEF1.2换成1 mL质量浓度为2.1.62 mg・L-1荧光素钠的DEMEF1.2液，分别于作用后的1.5，30，60，90，1.20 min，从接受池中取出100 μL渗透液，立即补充相同体积的空白DEMEF1.2液。测定渗透液中荧光素钠的荧光强度，计算荧光素钠的浓度。参考文献[15]，按下式计算渗透系数Papp= （dQ/dt）/（1/A×C0 ）。其中dQ/dt为荧光素钠的转运速度，A为Transwell池的扩散面积（A=4.67 cm2），C0为供体池中的初始浓度。

2.2冰片对BMECs和AS细胞活性的影响

取融合度为80%～90%的细胞，按5×105个/cm2的密度接种于96孔板，分为空白对照组、正常对照组和试验组共7个组。空白对照组不加入细胞，正常对照组用等体积的DHanks液代替药物，各实验组加入葛根素（100 mg・L-1）、梓醇（2.2.5 mg・L-1）和冰片（质量浓度分别为1，10，50，100，200 mg・L-1）的DHanks混合溶液100 μL。药物作用2.4 h后，每孔加入5 g・L1 的MTT液20 μL，3.7 ℃孵育4 h。终止培养，弃去上清液，加1.50 μL DMSO，振摇混匀10 min。测定4.90 nm 处的吸光度，按下试计算细胞存活率，选择存活率大于90%的冰片进行后续试验。

细胞存活率=[（Asample-Ablank）/（Acontrol-Ablank）]×100%

2.3冰片促进葛根素和梓醇跨BBB模型的转运试验

在共培养的第7天，供体池和接收池分别加入1，2 mL DHanks，平衡30 min后吸去供体池中的液体，然后加入1 mL葛根素、梓醇与冰片的混合溶液（葛根素、梓醇的质量浓度分别为100，2.2.5 mg・L-1），冰片质量浓度分别为0，62.5，1.2.5，2.5，50，100 mg・L-1），于给药后的1.5，30，60，90，1.20 min，分别取接收池中的液体100 μL，同时补充相同体积的空白DHanks液，参照文献[16]分别测定渗透液中葛根素和梓醇含量，并计算药物的渗透系数。同时测定冰片作用2 h后，共培养模型的跨内皮细胞电阻值。

2.4冰片促进葛根素和梓醇口服吸收入脑的动物试验

2.4.1葛根素和梓醇纳米晶混悬液的制备

精密称取葛根素050 g，梓醇01.1 g，加入50 mL纯水，探头超声（功率为800 W，工作时间5 s，间隙时间5 s，全程时间5 min），制得粒径为（1.2.73±3.5.3） nm，Zeta电位为（-2.75±2.4.2） mv，室温条件下可稳定1 h的纳米晶混悬液。

2.4.2药动学试验

健康KM小鼠2.1.6只随机分为4组：分别灌胃50%乙醇水溶液（对照组），剂量为2.5，50，100 mg・kg-1的冰片乙醇水溶液，再立即灌胃给予葛根素（200 mg・kg-1）和梓醇（4.5 mg・kg-1）的纳米晶混悬溶液。各组动物在灌胃后 01.67，05，075，1，2，4，6，8，1.2 h 摘眼球取血，3 000 r・min-1离心10 min，制得血浆样品。处死小鼠，取脑组织，剥离血管，称重，加入脑组织质量1.5倍的生理盐水，9 000 r・min-1匀浆2 min，1.3 000 r・min-1离心10 min，收集上清液。HPLCMS/MS测定血浆与脑组织匀浆中葛根素和梓醇的含量。

2.4.3数据处理

绘制各组的血药浓度时间曲线和脑药浓度时间曲线，用DAS 2.1软件计算药动学参数。采用t检验比较各组间AUC，AUC脑/AUC血的差异。

3结果

3.1BBB模型的鉴定

细胞共培养第7天，单层细胞与共培养模型的跨内皮细胞电阻值和荧光素钠的渗透系数见表1。共培养模型的跨内皮细胞电阻值显著高于单细胞培养（P

3.2冰片对BMECs和AS细胞活性的影响

当冰片质量浓度为1～200 mg・L-1时，细胞的存活率均大于90%。可见，在1～200 mg・L-1，冰片对BMECs和AS 2种细胞的活性均无影响。

3.3冰片促进葛根素和梓醇入脑的细胞试验

3.3.1冰片促进葛根素和梓醇跨BBB模型的转运试验

不同浓度的冰片对葛根素和梓醇跨BBB模型的渗透系数见表2。冰片质量浓度为62.5 mg・L-1时，梓醇、葛根素的渗透系数无显著性增加；质量浓度为1.2.5，2.5，50 mg・L-1时，渗透系数均显著增大（P

3.3.2冰片作用于共培养模型2 h后的跨内皮细胞电阻值

不同浓度的冰片作用于共培养模型2 h后，跨内皮细胞电阻值见表3。当冰片的质量浓度为62.5 mg・L-1时，电阻值与对照组相比无显著性差异；当冰片质量浓度为1.2.5～100 mg・L-1时，电阻值极显著下降（P

3.4冰片促进葛根素和梓醇口服吸收入脑的动物实验

小鼠给药后的血药浓度时间曲线和脑药浓度时间曲线见图1，2。药动学参数见表4～7，脑靶参数见表8。各浓度冰片血浆、脑组织中AUC0t及AUC脑/AUC血的t检验结果见表9。

4讨论

BBB在解剖学上是一层连续的，覆盖在99%脑毛细血管表面的内皮细胞膜。BBB由3部分组成：最内层为脑毛细血管内皮细胞及其紧密连接，中间为基质和周细胞，最外层是星形胶质细胞和细胞外基质，其中脑微血管内皮细胞是构成BBB的结构基础。但是研究发现，单独培养脑微血管内皮细胞会逐渐丧失BBB的特性，在培养体系中加入星型胶质细胞后能够较好地模拟体内环境，可以较好地保留BBB的特性[1.71.8]。因此体外常采用微血管内皮细

胞和星型胶质细胞共培养的模型模拟BBB。本实验证明，2种细胞共培养第7天时，跨内皮电阻值增大，显著高于细胞单独培养，荧光素钠的渗透系数显著低于细胞单独培养，说明屏障功能基本形成，这与文献[19]报道一致。虽然脑微血管内皮细胞与星型胶质细胞共培养能够较好地保留BBB的特性，但操作过程较繁琐，且重现性差。还可以用MDCK

pHaMDR（或称MDCK MDR1）细胞单层模型模拟

BBB，测定的体外数据与体内数据具有较高的相似性，且实验容易进行，重现性好[202.2]。后续可用此模型进行冰片促透BBB机制的深入研究。冰片促进葛根素和梓醇跨BBB模型转运的实验结果表明，冰片对葛根素和梓醇透过BBB的促进作用与冰片浓度有关：冰片质量浓度为62.5 mg・L-1时促透作用不明显；质量浓度增至为1.2.5，2.5，50 mg・L-1时，促透作用显著；但当冰片的质量浓度继续增加至100 mg・L-1时，促透作用反而略有降低。冰片作用2 h后，加入冰片组（1.2.5～100 mg・L-1）的跨内皮细胞电阻值显著降低。说明，冰片促进梓醇、葛根素透过BBB的作用与其开放血脑屏障有关。除此之外，冰片的促透机制还可能有：①影响P糖蛋白活性；②通过升高大鼠下丘脑组胺和5羟色胺的含量介导BBB开放；③影响ABC转运体部分蛋白的表达[2.3.2.4]，但这些机制是否与梓醇、葛根素穿透BBB有关，还需进一步研究。

冰片促进葛根素和梓醇口服吸收入脑的动物实验结果表明，冰片对葛根素和梓醇口服吸收有不同的影响。冰片剂量为50 mg・kg-1和100 mg・kg-1时能显著促进葛根素的口服吸收，分析原因可能为：①葛根素为溶解性差，渗透性差的生物药剂学Ⅳ类药物，冰片可能打开小肠上皮细胞间的紧密连接，提高葛根素的渗透性；②冰片能够抑制Pgp的活性[25]，而葛根素是Pgp的底物[26]。不同剂量的冰片均不影响梓醇的口服吸收。其原因可能是梓醇为强水溶性药物，口服绝对生物利用度为4.86%[27]，吸收较好，因此冰片对其的促吸收作用不显著。

冰片剂量为100 mg・kg-1时葛根素的脑靶向指数显著高于其余3组（P

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