西兰花提取物萝卜硫素抑制肺癌细胞的生长和侵袭
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇西兰花提取物萝卜硫素抑制肺癌细胞的生长和侵袭范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
【摘 要】萝卜硫素是从十字花科蔬菜中提取的多功能物质，研究已证实其具有抗癌、抗氧化等功效。肺癌是恶性程度高、具有转移倾向的恶性肿瘤，萝卜硫素抗肺癌的机制尚不是十分清楚。本研究通过CCK-8和transwell侵袭实验分析初步判断萝卜硫素对A549肺癌细胞活性和转移侵袭的影响，计算体外干预A549的IC50， 流式细胞学分析IC50浓度萝卜硫素对细胞周期和凋亡的影响，电泳分析DN段化改变。结果显示A549细胞活性对萝卜硫素剂量依赖性下降，萝卜硫素作用于A549 细胞的IC50 为3μg/mL， 该浓度的萝卜硫素抑制了A549细胞的转移侵袭，阻滞细胞于G2/M期，诱导细胞凋亡并使DNA发生片段化变化，下调TGF-β和NF-κB的表达。结果提示萝卜硫素可以抑制肺癌细胞的生长和侵袭，抑制炎症蛋白的表达，是肺癌辅助治疗的新途径。
【关键词】萝卜硫素；肺癌；生长抑制；凋亡
【中图分类号】R426 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）07-4589-02
【Abstract】Sulforaphane was a multifunction compound derived from brassicaceous vegetable such as broccoli， reports showed that Sulforaphane provided with effection of antitumor and antioxidant. Lung cancer is an aggressive malignancy with a tendency of early distant metastases， the antitumor function of sulforaphane was corroborated by numerous lines of evidence， but the anticancer mechanism of this compound has not been well obsvered. In this work， we analyzed vitality and invasion of A549 cells treated with sulforaphane by cell counting kit （CCK8） and transwell， then measure the half maximal （50%） inhibitory concentration （IC50） of sulforaphane for A549 cells. The cells cycle， apoptosis and DNA fragment were analyzed using Flow Cytometry Analysis and agarose electrophoresis， TGF-βand NF-κB were analyzed by western blot after treatment with 3μg/mL sulforaphane. Results showed that A549 cells proliferate and invade were inhibited by sulforaphane with a dose-dependent manner， IC50 of sulforaphane was 3μg/mL， and the cell cycle were arrested at G2/M phase. 3μg/mL sulforaphane induced apoptosis ， DNA fragment， decreased the expression of TGF-βand NF-κB in A549 cells. Our results pointed out that sulforaphane inhibited proliferation and invasion of lung cancer A549 cells in vitro， decreased the expression of inflammation proteins， maybe a novel chemotherapy for lung cancer..
【Key words】Sulforaphane；lung cancer；inhibition of proliferation；apoptosis
目前恶性肿瘤成为世界范围内引起死亡的主要原因，而且癌症的发病率呈逐年上升的趋势。中国人群中肺癌是所有肿瘤中发病率、死亡率最高的肿瘤，我国每年新发肺癌患者约70万人，其中大部分的患者初诊时已失去手术机会[1]。随着我国经济的迅速发展，环境污染影响了人们的健康。有气象研究者通过长期监测发现，我国肺癌发病率近几十年来上升4倍，灰霾是一个根本原因，肺癌的防治引起了学术界的广泛关注。在无法逃避的环境问题下，能否用食品或者药材预防甚至减少肿瘤的发生也是科研工作者思考的问题。
肺癌诊断的敏感性依赖于影像技术的发展而不是生物标记，往往确诊病人已是肺癌病程的中晚期，尽管手术治疗和化疗是目前肺癌常规的治疗方案，但是手术的创伤和化疗的不良反应对本就抵抗力下降的病人雪上加霜[2]。中医中药认为药补不如食补，从食物中获得具有预防肿瘤的活性物质从整体提高人群的抵抗力意义重大。从天然植物甚至食用植物中提取具有抗肺癌活性的物质十分必要，同时可以指导人群的健康饮食。萝卜硫素（1-异硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷） （Sulforaphane，SFN），又称“莱菔硫素” ，是从蔬菜中发现的抗癌效果良好的植物活性物质，在西兰花、芥蓝等十字花科植物中含量十分丰富[3]。萝卜硫素是一种多功能酶诱导物，可诱导产生II型解毒酶从而产生抗癌作用[4]。大量实验证明，萝卜硫素能够在体外抑制不同肿瘤细胞的生长并诱导凋亡[5]，但是萝卜硫素的作用机制目前尚不明确。
1 实验材料和仪器
1.1材料和药品
A549肺癌细胞株购自上海中科院细胞研究所，西兰花提取物SFN购自Toronto Reseach Chemicais Inc，含量为99%（S68815，3-KMT-175-3）。
1.2试剂和仪器
1640培养基、胰蛋白酶（0.25% Trypsin）购自美国gibco公司，胎牛血清（FBS）购自Hyclone公司，100×青-链霉素（100×P.S.）由杭州昊天生物技术有限公司提供，乙二胺四乙酸 （EDTA）购自晶科化工，cell counting kit（CCK-8）试剂盒购自上海东仁化学科技有限公司，Annexin V-FITC和PI试剂购自美国gibco公司。细胞培养板、培养瓶和transwell小室购自美国Corning公司，其余试剂均为国产分析纯。
台式离心机、二氧化碳培养箱购自美国Thermo公司，倒置荧光显微镜购自Nikon公司（ECLIPSE Ti-S型），微量加样器购自Thermo公司，全波长酶标仪购自美国MD公司（spectra Plus 384型），流式细胞分析仪购自美国BD公司（Accuri- C6）。
2 试验方法
2.1 细胞培养：复苏A549细胞，用10%FBS 1×P.S. 1640培养基37℃，5%CO2培养箱孵育培养，使用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，0.25%Trypsin+0.02%EDTA消化细胞进行传代培养并调整细胞状态。
2.2 细胞活力检测：取生长对数期细胞，0.25% Trypsin +0.02%EDTA消化离心，计数后，以4×103/well铺96孔板，37℃，5%CO2培养箱孵育培养。24h后，分组加药SFN （调零组，正常组，0.625μg/mL组，1.25μg/mL组，2.5μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL），培养24h后，使用CCK-8试剂盒检测细胞活力。独立实验重复三次。
2.3细胞侵袭实验：将在4℃融好的Matrigel用冷的无血清RPMI-1640培养基稀释，取100μL稀释胶（25μg/孔）加到24-well transwell上室。放置37℃孵育过夜包被基底膜，取出transwell板，用无血清RPMI-1640培养基轻洗凝胶。分别消化3μg/mL SFN作用24h后的细胞，用1%FBS RPMI-1640制备2.5×105/ml细胞悬液。取200μL加入上室，下室加入10%FBS RPMI-1640培养基。培养箱培养24h后移去transwells，用棉签擦去上室非侵袭细胞，倒置，风干。在24孔板中加入500μL 0.1%结晶紫，把小室放入其中，37℃孵育30min。取出，PBS清洗，随机取四个视野，照相、计数并做统计学分析。
2.4 流式检测细胞周期和凋亡：调整细胞浓度为1×105个/mL，以2 mL每孔接种于6孔培养板；将6孔培养板中培养基换成无血清的培养基，同步化培养37℃，5% CO2饱和湿度培养箱内培养24h。弃去原培养基，加入3 μg/mL SFN 到A549细胞中，每组均设3个复孔，置37℃，5% CO2饱和湿度培养箱内培养24h。用0.25%胰酶消化细胞，1500RPM，5min，离心收集，弃培养基；用冷PBS洗涤细胞两次；加冰75%乙醇在-20℃固定24小时；1500RPM，离心时间5min后弃乙醇，风干，加PBS洗两遍（1500RPM，离心时间5min 收集细胞），加入1毫升Reagent A振荡混匀5-10秒，孵育30分钟后上机检测细胞周期。同上培养收集细胞，冷PBS洗涤细胞两次后用500μL 1×Binding Buffer悬浮细胞；在细胞悬浮液中加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI，轻轻混匀后避光条件下孵育5min后上机（BD公司，C6，USA）检测细胞凋亡。独立实验重复三次。
2.5 核酸电泳检测A549 DN段：将对数生长期的细胞接种至T75的培养瓶，37 ℃，5% CO2饱和湿度培养箱中培养12h，按终浓度3μg/mL SFN向T75培养瓶中加入适量体积的含药培养基，药物作用24h。离心收集细胞后，加400μl细胞裂解液，充分混匀后加蛋白酶K 8μL，置55℃水浴消化20min。取出样品，经酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）和75%乙醇抽提，将上述DNA样本取2μL进行浓度及纯度测定，取约1μg进行琼脂糖凝胶电泳（2%），80V持续2h。
2.6 免疫印迹检测萝卜硫素对蛋白表达的影响：用胰酶消化贴壁细胞， 加入含PMSF的裂解液，BCA法测定蛋白浓度。制备12%分离胶和5%浓缩胶，30 μg/孔上样电泳后，经转膜、封闭、一抗和二抗孵育后，ECL试剂盒中等体积的A液和B液混合，混匀后加在膜的表面，移入凝胶成像分析仪中，化学光敏模式曝光显影。独立实验重复三次。
2.7 统计学分析：数据表示为平均值±标准差，统计分析利用SSPS 17.0软件（单方差分析），p
4 讨论
由于近期日益严重的环境污染，近几十年来，肺癌在我国的发病率和病死率急剧上升。肺癌的病死率极高，平均5年生存率不到10%[6]，因此，早期发现、早期诊断、争取采用以手术为主和放化疗为辅的综合治疗措施，是提高肺癌生存率的关键[7]。流行病学显示增加果蔬类的消耗和减少某些肿瘤发病率之间有一定联系[8]，从日常饮食中寻找具有抗癌、抑癌生物活性的食材，不仅可以防患于未燃，而且可以在发病的早期提供有效的抗肿瘤辅助，抑制肿瘤迅速发展的态势，有效延长病患的生存期[9]，符合中医整体治疗和治未病的观念。研究食品中的抗癌、抑癌活性成分可以指导人们的日常饮食习惯，通过调整食谱中蔬菜的结构，起到有病防病、无病健身、提高机体素质的作用。
肺癌起源于支气管粘膜上皮，局限于基底膜内者称为原位癌癌肿[10]，根据其生理结构可向支气管腔内或/和临近的肺组织生长，并可通过淋巴管、血管或经支气管转移扩散[11]。除了可以在局部形成实体瘤以外，肺癌还可以形成远处器官的转移瘤。其中来源于支气管或细支气管表皮细胞的恶性肿瘤，占了肺实质恶性肿瘤的90-95%[12]。癌瘤生长速度和转移扩散的情况与癌瘤的组织学类型分化程度等生物学特性有一定关系，与患者的身体状态、药品以及食品的干预有关[13]。然而，常规使用的一线化疗药物多具有一定的毒性，对患者的身体造成一定的损害，放、化疗的应用对于患者对于肺癌患者而言无疑雪上加霜。如果能有一种具有无毒、防癌、抑癌、抗癌效果的食品或者蔬菜提供给群众，将对人体健康提供极大的帮助，也必将产生一定的社会效应。
西兰花是草本植物，属十字花科芸苔属甘蓝种，其食用部分为绿色幼嫩花茎和花蕾，富含蛋白质、维生素和胡萝卜素，钙、磷、铁、钾、锌、锰等含量也很丰富，营养成份位居同类蔬菜之首[14]。有文献提示，西兰花不但能给人补充一定量的硒和维C，同时也能供给丰富的胡萝卜素，起到阻止癌前病变细胞形成的作用 [15]，抑制癌肿生长，特别是西兰花提取物萝卜硫素被证实是主要防癌、抗癌活性物质[16]。
本研究以A549肺癌细胞为对象，以萝卜硫素（SFN）为干预药物，体外观察西兰花提取物对肺癌细胞生长和侵袭的影响。实验结果证实，低浓度的SFN对A549细胞低或无抑制作用，中、高浓度的SFN不但抑制了肺癌细胞的生长、抑制了细胞的侵袭，也改变了细胞的周期，使肺癌细胞阻滞在G2/M期。细胞长期处于G2/M期，将走上死亡或者凋亡[17]。随后的实验进一步证实，IC50浓度的SFN诱导了肺癌细胞DNA的断裂，呈现DNA梯状化伴随凋亡细胞增加， 而转化生长因子（Transforming growth factors-β， TGF-β）通路蛋白表达水平下降。
TGF-β家族是一类功能复杂的细胞因子[18]，它广泛参与哺乳动物的各种生理和病理过程，与细胞的增殖、分化、凋亡和迁移有关 ， TGF-β的过表达在肿瘤发生与进展、创伤愈合、血管生成和恶化程度密切相关[19]。同时还有资料显示TGF-β调节失常对肿瘤的发展和病人的预后有重要的影响。TGF-β介导的信号转导主要通过激活Smads通路实现[20]，Smads的变异和失调对肿瘤的发展有重要作用[21]。TGF-β/Smad信号通路在炎症相关肿瘤的研究是一大热点，TGF-β可以引起组织的纤维化，加强肿瘤细胞与胞外基质的相互作用，也是肿瘤细胞容易迁移并侵袭正常组织的原因之一[21]。因此，TGF-β在肿瘤的发展中起到了促进作用[22]，研制以TGF-β为作用靶点的药物虽然还需要动物实验的证实，但是我们的体外研究结果提示，西兰花提取物萝卜硫素能够降低TGF-β的表达水平，介导TGF-β通路中Smad2及其核转录因子NF-κB的下降，为萝卜硫素体内实验的进一步开展奠定了良好的开端，推进中药现代化研究。萝卜硫素的体内实验是本研究的下一步计划。
参考文献
[1] Chaleunvong K， Kamsa-ard S， Suwanrungruang K， Wiangnon S， Sychareun V， et al. （2013） Retrospective Appraisal of Cancer Patients from Vientiane Capital City， Lao People’s Democratic Republic （PDR）， Seeking Treatment in Thailand. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention 14： 5435-5440.
[2] Bach PB， Mirkin JN， Oliver TK， Azzoli CG， Berry DA， et al. （2012） Benefits and harms of CT screening for lung cancer： a systematic review. Jama 307： 2418-2429.
[3] Abbaoui B， Riedl KM， Ralston RA， ThomasAhner JM， Schwartz SJ， et al. （2012） Inhibition of bladder cancer by broccoli isothiocyanates sulforaphane and erucin： Characterization， metabolism， and interconversion. Molecular nutrition & food research 56： 1675-1687.
[4] Chaudhuri D， Orsulic S， Ashok BT （2007） Antiproliferative activity of sulforaphane in Akt-overexpressing ovarian cancer cells. Molecular cancer therapeutics 6： 334-345.
[5] Singh AV， Xiao D， Lew KL， Dhir R， Singh SV （2004） Sulforaphane induces caspase-mediated apoptosis in cultured PC-3 human prostate cancer cells and retards growth of PC-3 xenografts in vivo. Carcinogenesis 25： 83-90.
[6] Chen W， Zhang S， Zou X （2010） Evaluation on the incidence， mortality and tendency of lung cancer in China. Thoracic Cancer 1： 35-40.
[7] Pass HI， Beer DG， Joseph S， Massion P （2013） Biomarkers and molecular testing for early detection， diagnosis， and therapeutic prediction of lung cancer. Thoracic surgery clinics 23： 211-224.
[8] 迟宝峰， 毕力夫， 苏秀兰 （2010） 乳腺癌与饮食关系流行病学研究进展. 内蒙古医学院学报 32.
[9] Mohamed S， Hashim SN， Rahman HA （2012） Seaweeds： a sustainable functional food for complementary and alternative therapy. Trends in Food Science & Technology 23： 83-96.
[10] Paik JH， Choe G， Kim H， Choe J-Y， Lee HJ， et al. （2011） Screening of anaplastic lymphoma kinase rearrangement by immunohistochemistry in non-small cell lung cancer： correlation with fluorescence in situ hybridization. Journal of Thoracic Oncology 6： 466-472.
[11] 王健康， 董晓莉， 陈孝果， 顾国利 （2013） 1 肺癌患者淋巴结转移与免疫组化及其病理学改变的相关性分析. 中国循证医学杂志 13： 137-142.
[12] 何平， 孙平军， 鹿翠香 （2012） 肺癌病理分型与临床表现及个人史关系的探讨. 实用心脑肺血管病杂志 20： 1646-1647.
[13] Talmadge JE， Fidler IJ （2010） AACR centennial series： the biology of cancer metastasis： historical perspective. Cancer research 70： 5649-5669.
[14] Hu C （2012） Factors Affecting Phytochemical Composition and Antioxidant Activity of Ontario Vegetable Crops.
[15] Li Y， Wicha MS， Schwartz SJ， Sun D （2011） Implications of cancer stem cell theory for cancer chemoprevention by natural dietary compounds. The Journal of nutritional biochemistry 22： 799-806.
[16] Li Y， Zhang T， Korkaya H， Liu S， Lee H-F， et al. （2010） Sulforaphane， a dietary component of broccoli/broccoli sprouts， inhibits breast cancer stem cells. Clinical Cancer Research 16： 2580-2590.
[17] ABBAOUI B， RIEDL KM， RALSTON RA， THOMAS-AHNER JM， SCHWARTZ SJ， et al. （2012） Inhibition of bladder cancer by broccoli isothiocyanates sulforaphane and erucin： Characterization， metabolism， and interconversion. Molecular nutrition & food research 56： 1675-1687.
[18] Liao W， Lin J-X， Leonard WJ （2011） IL-2 family cytokines： new insights into the complex roles of IL-2 as a broad regulator of T helper cell differentiation. Current opinion in immunology 23： 598-604.
[19] Hong M， Zheng J， Ding Z-y， Chen J-h， Yu L， et al. （2012） Imbalance between Th17 and Treg cells may play an important role in the development of chronic unpredictable mild stress-induced depression in mice. Neuroimmunomodulation 20： 39-50.
[20] Sundqvist A， Zieba A， Vasilaki E， Hidalgo CH， S?derberg O， et al. （2012） Specific interactions between Smad proteins and AP-1 components determine TGFβ-induced breast cancer cell invasion. Oncogene.
[21] Buchanan CF， Voigt EE， Szot CS， Freeman JW， Vlachos PP， et al. （2013） Three-Dimensional Microfluidic Collagen Hydrogels for Investigating Flow-Mediated Tumor-Endothelial Signaling and Vascular Organization. Tissue Engineering Part C： Methods 20： 64-75.
[22] Meulmeester E， ten Dijke P （2011） The dynamic roles of TGFβ in cancer. The Journal of pathology 223： 206-219.
基金项目：
浙江省自然科学基金（LY12H16007）；浙江省科技厅钱江人才项目（2013R10072）
作者简介：
贾侃，男，硕士，研究方向为抗肿瘤研究。Tel： 18516293680 E-mail：
*通讯作者：
许 健，Tel：（0571）86633001； E-mail： ；