血管钠肽通过抑制白细胞L-选择素表达保护碾压撕脱皮瓣

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[摘要]目的:本研究组以往的工作已证实血管钠肽(Vasonatrin peptide,VNP)对碾压撕脱伤皮瓣有明显的保护作用,本研究拟探讨该作用是否通过抑制皮瓣损伤后白细胞的l-选择素表达介导。方法:24只大鼠随机分为3组(n=8),分别为SHAM手术组、碾压撕脱组及VNP+碾压撕脱组,于术前及术后12h取材,HE染色观察组织学改变和白细胞浸润情况,并通过免疫组织化学染色对表达于白细胞表面的L-选择素进行标记以明确VNP对碾压撕脱皮瓣的具体作用。结果:碾压撕脱组皮瓣组织损伤情况较重,可见大量中性粒细胞浸润,其表面的L-选择素表达也随之升高,而VNP治疗组皮瓣中的中性粒细胞数目明显减少,其所表达的L-选择素也较前者显著降低(P

[关键词]血管钠肽;白细胞;皮瓣碾压撕脱伤; L-选择素

[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)03-0337-04

Vasonatrin Peptide(VNP)protected the crush-avulsion injured skin flap from necrosis via inhibition of the expression of L-selectin on leucocytes

WANG Shi-ping,LAN Zhi-yong,XIA Wei,GUO Shu-zhong,ZHAO Qian,LIU Bei,PAN Bao-hua

(Institute of Plastic Surgery of People's Liberation Army,Xijing Hospitol,the Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,Shaanxi,China)

Abstract:ObjectivePrevious studies of our group showed that the Vasonatrin peptide(VNP)had protective effect on the cursh-avulsion injured skin flap. This study was designed to investigate whether the protection effect of VNP conducted via inhibition of expression ofL-selectin on leucocytes.MethodsTwenty four rats were randomly divided into three groups: the SHAM operation group, the crush injury group and the VNP treated group. Tissue samples from skin flap were collected before surgery and 12h after surgery, Hematoxylin-eosin stain was used to observe the histological change and inflammatory cell infiltration. Immunohistochemistry was applied to detect the expression of L-Selectin on leucocytes in the skin flap of each group, by which we can affirm the effects of VNP. ResultsCompared with the VNP treated group, tissue damage was more serious and a mass of inflammatory cell infiltration was observed, and the expression of L-Selectin was significantly higher(P0.05) in the crush injury group. Conclusion VNP,which could mitigate inflammatory reaction and inhibit thrombosis by decreasing the inflammatory cell infiltration and down regulating the expression of L-Selectin in the crush injury, has the potential to be a new therapeutic drug for clinical application.

Key words: Vasonatrin peptide (VNP); Leucocytes; Flap crush injury; L-Selectin

我们以往研究证实,在碾压撕脱伤发生后,会发生非常复杂的病理生理学改变,其中白细胞对组织损伤会发挥重要的作用,参与了炎症反应和血栓的形成,白细胞在炎症反应区域集中,对炎症的加重及血栓的形成和发展起到关键的作用,进而造成碾压撕脱组织内形成广泛的微血栓,导致组织缺血引起撕脱继发性坏死的发生[1]。碾压撕脱伤发生后,白细胞首先通过在血管壁上缓慢滚动开始发挥其在炎症反应中的作用,而白细胞与血管壁接触这一使动步骤是由其表面的L-选择素通过与相应配体结合来介导的[2]。本实验观察应用血管钠肽(Vasonatrin peptide,VNP)后碾压撕脱皮瓣组织中白细胞浸润和L-选择素表达情况的改变,研究其对碾压撕脱皮瓣组织的保护作用机制,为临床救治提供指导。

1材料和方法

1.1 实验动物模型及分组:清洁级SD大鼠24只(第四军医大学实验动物中心提供),雌雄不限,体重220-280g,普通喂养。将24只大鼠随机分为三组,每组8只,A组为SHAM手术组(皮瓣掀起后直接原位缝合,不进行碾压撕脱),B组为单纯碾压撕脱组(生理盐水1ml/kg腹腔注射, 1次/日),C组为碾压撕脱伤后VNP治疗组(VNP 0.1mg/kg静脉注射, 1次/日)。实验方法详见先前实验[3],简述为:在大鼠背部形成3cm×9cm长方形任意皮瓣,使用皮肤碾压撕脱伤模型机制作碾压撕脱伤皮瓣模型(第四军医大学西京医院整形外科研制,专利号:ZL 2008 2 0221813.3)。

1.2免疫组织化学:术前及术后12h,各组于皮瓣中远1/3交界处切取全层皮瓣组织1cm×2cm,所取组织立即用10%福尔马林固定,石蜡包埋备用。各组皮瓣组织标本分别进行常规HE染色及免疫组织化学染色。本实验采用免疫组织化学超敏S-P试剂盒(购于福州迈新生物技术开发有限公司)对组织进行染色,具体染色步骤按照先前实验进行[3];一抗L-Selectin(购于Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)。结果判定:胞质中有棕黄色颗粒者为阳性。每张切片在高倍镜(400倍)下随机选取5个不重复视野,在同一背景条件下取图并进行灰度处理后用Image-Pro Plus6.0软件测定平均积分光密度(IOD)。

1.3统计学处理:实验数据以x±s表示,用SPSS12.0(SPSS Inc. Chicago, Illinois)统计软件处理,组间比较用采用方差分析,P0.05,差异有显著性。

2结果

2.1 皮瓣成活率:通过我们的前期工作已证明,使用我科自行研制的皮肤碾压伤模型可以制作出稳定可重复的碾压皮瓣。皮瓣碾压后,组织自远端1/3开始逐渐发生干性坏死,随着时间推移,原本看似有活力的组织也开始发生坏死表现,表皮脱屑、变硬等继发性坏死特征相继出现,至术后7天坏死和成活组织呈现明显界限。此时计算各组皮瓣的成活率(皮瓣成活率=皮瓣存活表面积/皮瓣总表面积×100),结果如下:A组(SHAM): 61.12±4.92;B组(单纯碾压撕脱):37.42±4.36;C组(碾压撕脱+VNP):49.96±1.32。 可以看出VNP治疗能显著提高皮瓣的成活面积(P

2.2 组织损伤和白细胞浸润:为进一步了解碾压伤后组织损伤情况和VNP的作用,我们选择在伤后12h于皮瓣中远1/3交界处取材,进行组织学检测。HE染色见SHAM手术组皮瓣组织形态正常、结构完整,未见明显炎细胞浸润,微血管中血流通畅(图1)。碾压撕脱组皮瓣可见组织的形态和完整性遭到明显破坏,大量炎细胞浸润,血管内可见明显中性粒细胞大量出现,部分管腔内充满中性粒细胞,可见白细胞贴壁,有附壁血栓形成(图2)。VNP治疗组皮瓣组织损伤情况得到明显改善:组织虽有水肿,但其形态结构尚完整,炎细胞浸润较单纯碾压皮瓣有明显减少,大多聚集在血管壁外周,管腔内充血,仅有少量中性粒细胞存在于管腔之中,可见白细胞附壁现象,尚未见明显血栓形成(图3)。

2.3 L-选择素免疫组织化学染色:L-选择素表达于多种白细胞,包括中性粒细胞、单核细胞等,是介导白细胞与内皮细胞初始作用和滚动的主要黏附分子[4],因此我们挑选了L-选择素这一指标来研究白细胞在碾压撕脱伤中的作用。术前各组切片中L-选择素表达未见明显差异(P>0.05)。术后12h切片:SHAM手术组中L-选择素阳性表达的细胞不多,多呈黄色、棕黄色等弱阳性表现(图4);碾压撕脱组皮瓣可观察到大量L-选择素阳性表达的细胞,且呈棕褐色的强阳性表现,并其多位于管腔内及血管周围,尤其在管腔内呈大量聚集表现,这与中性粒细胞聚集部位相一致,证明了在碾压撕脱伤早期白细胞因L-选择素的高表达而聚集于管腔之中,并最终渗出浸润至组织各处参与炎性反应过程(图5);VNP治疗组中L-选择素的表达较碾压撕脱组明显减少,散在于管腔及内皮细胞周围,说明VNP较好地抑制了白细胞在炎症反应中的作用(图6)。术后12h各组间平均积分光密度(IOD)差异具有显著性(P

3讨论

皮肤碾压撕脱伤是整形外科的常见损伤,其损伤可分为原发性坏死和继发性坏死,其中继发性坏死往往导致伤后碾压撕脱皮瓣大面积受损,是皮肤碾压撕脱伤所特有的损伤特点,给患者的救治及预后恢复带来很大难度。我科通过长期研究总结出继发性坏死的主要病理改变为:血管内皮细胞损伤脱落,白细胞贴壁黏附、血管周围大量炎性细胞浸润,碾压撕脱皮瓣中血流明显下降,血管内大量微血栓形成。我们通过活体荧光观察发现[5],在碾压伤发生后30min左右即可见少量白细胞随血流沿血管壁游走滚动,后滚动速度逐渐减慢,最终停止而黏附于血管壁之上。而后随着黏附的白细胞越聚越多,最终形成血栓阻塞管腔,可见白细胞的贴壁黏附形成附壁血栓是造成微循环障碍的主要原因。根据碾压撕脱伤后以白细胞为代表的组织病理学改变及以往研究结果我们能得出:选择素分子参与了继发性坏死的损伤过程,并对伤后白细胞贴壁滚动、黏附、渗出及组织的病理变化有重要的作用[6-7]。

选择素又称凝集素样细胞粘附分子(Lec-CAM),介导细胞与细胞之间的粘附,并具有高度选择性,分为E-、P-、L-选择素三个成员。L-选择素(或称为CD62L)广泛表达于多种白细胞,尤其是中性粒细胞,L-选择素集中表达于未激活的中性粒细胞的微绒毛顶端或膜的皱折部位,这可能利于与其内皮细胞配体及早接触[8],是整合素介导中性粒细胞牢固黏附的前提,在炎症反应的过程中起到重要的作用[9]。当创伤及炎性发生时,炎症介质首先活化血管内皮细胞,使其表达黏附分子的相应配体,同时,L-选择素表达量升高,并在创伤后24h内均处于高表达状态[10];此时,血流中的白细胞通过其表面所表达的L-选择素与其相应的内皮细胞配体结合,使原本在血流中随机运动的白细胞在切应力的作用下沿炎症附近血管缓慢滚动,这种“滚动”就是白细胞与内皮细胞牢固黏附的先决条件,而后随着L-选择素介导的细胞信号传导的白细胞激活和β2整合素的粘附加强作用,使白细胞活化、变形,穿越血管内皮细胞到血管外,最终移行到炎症区域释放炎症介质导致炎性反应造成组织纤维、坏死的等表现。因此,L-选择素可作为白细胞参与创伤后反应的标志之一。国外学者研究证明[11],通过阻止白细胞黏附,可显著地减少白细胞对微循环机能和组织的损害,而L-选择素介导白细胞的滚动、黏附与渗出[12],位于损伤改变的始动环节,在创伤中有十分重要作用。同时,我们根据以往研究也已证实[13],采用L-选择素的拮抗剂可减轻组织炎症症状,对缺血/再灌注损伤皮瓣起到一定得保护作用。因此使用一种可抑制或阻断L-选择素发挥作用,进而减少白细胞对组织的损害的药物,可能对碾压撕脱皮瓣起到一定的保护作用。

血管钠肽(Vasonatrin peptide,VNP),是一个人工合成的含有27个氨基酸(Aa)残基组成的多肽,它是心房钠尿肽(ANP)和C型钠尿肽(CNP)的嵌合物,在生物活性上兼具CNP和ANP的双重作用。国外的研究报道CNP可抑制白细胞动员并通过抑制P-选择素的表达起到抑制白细胞贴壁滚动和血小板凝集的作用[14],我们通过实验证明了VNP也具有抑制P-选择素表达的作用[3]。本实验显示,碾压撕脱伤后早期给予VNP进行治疗可同样起到抑制L-选择素表达的作用。与E-、P-选择素不同,即使没有刺激,白细胞表面也有少量L-选择素表达,在细胞因子、炎性介质及其他因素的作用下,其表达的水平可发生变化,脱落是调节其活性的主要方式,而其反复脱落与再表达则影响着白细胞的趋化性[15],故本研究中采用了平均积分光密度(IOD)这一客观性较强的指标对其组化结果进行比较。实验结果说明VNP可通过抑制L-选择素的表达起到抑制白细胞的贴壁及渗出浸润,减少血栓形成并减轻炎症反应,同时减少白细胞对微循环机能和组织的损害,进而提高皮瓣的成活率,对碾压撕脱皮瓣起到保护作用。此外,VNP是一种人工合成的多肽,体内可能缺乏特异性降解内肽酶,克服了其他钠尿肽代谢快、半衰期短的缺陷。因此,VNP有希望成为防治碾压撕脱皮瓣继发坏死的多肽,可为临床上提高碾压撕脱皮瓣成活率并改善预后提供一种新的治疗思路。

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[收稿日期]2009-12-02 [修回日期]2010-02-23