硫酸软骨素A钠注射液细菌内毒素检查方法研究

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摘要：目的建立检查硫酸软骨素A钠注射液细菌内毒素的方法。方法采用中国药典2005年版附录细菌内毒素检查法。结果硫酸软骨素A钠注射液浓度为0.15 mg・mL-1，用灵敏度为0.25 EU・mL-1的鲎试剂检测细菌内毒素，无干扰因素的影响。结论硫酸软骨素A钠注射液可用鲎试剂检查细菌内毒素。

关键词：硫酸软骨素A钠注射液；细菌内毒素；干扰试验

中图分类号：R927.11文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)11-0024-03

Study on Bacterial Endotoxin Test for Chondroitin Sulfate A Sodium Injection

JI Yang, GAO Jin, SHEN Juan, WANG Wen-Jun, HU Dan, NIE Yu-Qiong

(Institute for Drug and Instrument Control of Health Department GLD of PLA, Beijing 100071, China)

Abstract：Objective To establish the detection method of bacterial endotoxin for chondroitin sulfate A sodium injection. Methods The bacterial endotoxin test method in Chinese pharmacopoeia (2005 edition) was adopted. Results The bacterial endotoxin test was performed with TAL of 0.25 EU・mL-1, and the maximum noninterference concentration of chondroitin sulfate A sodium injection was 0.15 mg・mL-1. Conclusion The bacterial endotoxin can be detected by TAL in chondroitin sulfate A sodium injection.

Key words：chondroitin sulfate A sodium injection; bacterial endotoxin; interference test

硫酸软骨素A钠注射液主要用于治疗动脉硬化疾病、心绞痛、高脂血症等。临床用肌内注射方法给药。硫酸软骨素A钠注射液质量标准中已设立细菌内毒素检查项，规定检查限值为33 EU・mL-1[1]。我们选择灵敏度0.25 EU・mL-1鲎试剂检查硫酸软骨素A钠注射液细菌内毒素时，对应有效稀释浓度的硫酸软骨素A钠注射液对4个厂家的鲎试剂表现了不同程度的抑制作用，干扰了细菌内毒素的检查。我们认为，应依据中国药典2005年版二部附录细菌内毒素检查法[2]，对硫酸软骨素A钠注射液细菌内毒素进行检查。

1药物与试剂

硫酸软骨素A钠注射液（沈阳济世制药公司80 mg∶2 mL，10545205）；鲎试剂（见表1）；

细菌内毒素工作标准品（中国药品生物制品检定所，批号2003-3，效价150EU/支）；细菌内毒素检查用水（中国药品生物制品检定所，规格10 mL， 批号2005120）

2方法和结果

2.1细菌内毒素限值（L）的确定

根据本品说明书，硫酸软骨素A钠注射液用法用量为肌内注射，1次1～2 mL，每日1～2次。

公式：L=K/M

式中M为每千克体重每小时的最大供试品剂量，M=80 mg/(60 kg・h )，即1.33 mg/(kg・h)；K为每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，K= 5 EU/(kg・h) 。计算限值：3.75 EU・mg-1，即150 EU・mL-1。已有限值L=33 EU・mL-1，即0.825 EU・mg-1[1]。

2.2鲎试剂灵敏度复核实验

按照中国药典2005年版二部附录细菌内毒素检查法的规定复核鲎试剂的标示灵敏度， 结果见表2。

λ为鲎试剂标示灵敏度，λc为鲎试剂复核灵敏度

6批鲎试剂经用细菌内毒素国家标准品检查，λc/λ均在0.5～2.0之间，灵敏度复核结果均符合规定。

2.3干扰实验的预实验

2.3.1计算硫酸软骨素A钠注射液有效稀释浓度（MVC）公式MVC=λ/L ，式中L为硫酸软骨素A钠注射液的细菌内毒素限值0.825 EU・mg-1，目前市售鲎试剂λ通常为0.5～0.03 EU・mL-1。硫酸软骨素A钠注射液的对应有效稀释浓度则为：MVC0.5=0.5/0.825=0.606 mg・mL-1，MVC0.25=0.25/0.825=0.303 mg・mL-1，MVC0.125=0.125/0.825=0.151 5 mg・mL-1， MVC0.06=0.06/0.825=0.072 7 mg・mL-1，MVC0.03=0.03/0.825=0.036 36 mg・mL-1。

2.3.2实验操作将硫酸软骨素A钠注射液用细菌内毒素检查用水分别稀释为10，5，2，1，0.6，0.3，0.2，0.1，0.05 mg・mL-1溶液，将其中5，1，0.3，0.1，0.05 mg・mL-1浓度溶液记为NPC。同时在10，2，0.6，0.2 ，0.1 mg・mL-1试液中加入细菌内毒素标准溶液，使每一浓度的试液均含有2λ浓度的细菌内毒素，此系列溶液记为PPC。

取灵敏度0.25 EU・mL-1的鲎试剂，分别与PPC和NPC反应，每一浓度重复2管，并设阳性对照（PC）和阴性对照（NC）。结果见表3。

由表3可初步了解，4个厂家鲎试剂对硫酸软骨素A钠细菌内毒素的实验结果有差异，灵敏度为0.25 EU・mL-1鲎试剂，在0.05 mg・mL-1及其以下浓度时均无抑制干扰。

2.4正式干扰试验

为了最终确认是否存在抑制因素的影响，进行了正式干扰实验。

分别用细菌内毒素检查用水稀释硫酸软骨素A钠，使其最终干扰试验浓度为0.15 mg・mL-1，选择0.125 EU・mL-1灵敏度的鲎试剂，按中国药典2005年版二部附录的细菌内毒素检查供试品干扰试验项，结果见表4。

Es为细菌内毒素检查用水制成的细菌内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值；Et为用供试品溶液或其稀释液制成的细菌内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值。

正式干扰试验结果表明，硫酸软骨素A钠注射液浓度0.15 mg・mL-1时， Es/Et均在0.5～2.0范围内，确认无干扰影响。

2.5样品细菌内毒素检查

按中国药典2005年版二部附录细菌内毒素检查法，使用2批不同厂家的灵敏度为0.125 EU・mL-1鲎试剂分别检查样品的细菌内毒素，并设立样品的自身阳性对照，结果见表5。

3讨论

为确保临床用药安全有效，国家药典委员会计划进一步提高注射剂的质量标准。我们承担了提高硫酸软骨素A钠注射液质量标准的研究任务。我们选择4个厂家、灵敏度为0.25 EU・mL-1鲎试剂进行干扰预试验。结果表明，硫酸软骨素A钠注射液在0.05 mg・mL-1及其以下稀释浓度时无抑制性干扰。我们选择2个厂家、灵敏度为0.125 EU・mL-1鲎试剂，将硫酸软骨素A钠稀释为0.15 mg・mL-1，进行正式干扰试验，结果显示， Es/Et均在0.5～2.0范围，表明确无干扰影响。

本实验表明，硫酸软骨素A钠注射液适用于细菌内毒素检查，但需将样品稀释至0.15 mg・mL-1，选择0.125 EU・mL-1或更高灵敏度的鲎试剂。我们建议，硫酸软骨素A钠注射液质量标准中细菌内毒素检查项内应写明：取本品，制成0.15 mg・mL-1，依法检查，每1 mL含内毒素的量应小于33 EU。

参考文献

[1]WS-10001-(HD-1399)-2003. 国家药品标准第15册[S]. 2003：32-33.

[2]国家药典委员会中华人民共和国药典 2005年版二部 [M]. 北京：化学工业出版社，2005：附录85-88.