中肺合剂对小鼠Lewis肺癌肿瘤组织Survivin Caspase-3表达的影响

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(1.浙江省肿瘤医院,浙江 杭州 310022;2.浙江中医药大学药学院,浙江 杭州 310053)

摘 要:目的:观察中肺合剂对小鼠lewis肺癌肿瘤组织survivin、caspase-3基因表达的影响。方法:取C57BL/6小鼠50只,接种Lewis肺癌瘤株后,随机分阴性对照组(0.9%生理盐水),中肺合剂低、中、高剂量组(12.7g•kg-1、25.4g•kg-1、50.8g•kg-1),阳性对照组(环磷酰胺组,30mg•kg-1),每组10只。观察12天停药。无菌条件下取肿瘤组织,采用EnVision免疫组化方法测定中肺合剂对小鼠Lewis肺癌组织survivin、caspase-3蛋白表达的影响。结果:中肺合剂低、中、高给药组能不同程度下调Lewis肺癌小鼠肿瘤组织survivin蛋白的表达并上调caspase-3蛋白的表达,且均以中剂量组最显著,与生理盐水组相比统计学上有非常显著差异(P

关键词:中肺合剂; Lewis肺癌; EnVision法; survivin; caspase-3

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)04-0768-03

The Effects of Zhongfei Mixture on the Expression of Survivin and Caspase-3 in Tumor Tissues from the Mice Bearing Lewis Lung Carcinoma

ZHOU Xiaofang1, LIN Nengming1,2, XU Li2, HAN Jiangmin1,ZHANG Huicong2,ZHANG Rusong2

(1.Zhejiang Cancer Hospital,Hangzhou,310022,Zhejiang,China;

2.College of Pharmaceutical Sciences,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou,310053,Zhejiang,China)

Abstract:Objective: To observe the effects of Zhongfei Mixture(ZM) on the expression of survivin and caspase-3 in tumor tissues from the mice bearing Lewis lung carcinoma. Methods: Fifty C57BL/6 mice bearing Lewis lung carcinoma were divided into 5 groups:the saline control group, the low, mid and high-dose groups of ZM and Cyclophosphamide(CTX) group. Tumor tissues were isolated after 12 days followed by the expression detection of survivin and caspase-3 in tumor tissues by EnVision two-step immuno-histochemistry staining. Results: ZM could down-regulate the expression level of survivin and up-regulating caspase-3 in tumor tissues from the mice bearing Lewis lung carcinoma. Compared with saline control group, the effect of the mid-dose group was the most prominent and showed significantly different in statistics(P

肺癌是一种全身属虚、局部属实的疾病[1]。根据临床表现的特点,可以归于“咳嗽”、“痰饮”、“息奔”、“肺积”、“咯血”、“肺花疮”、“声”、“胸痛”等疾病范畴。肺癌的病因目前尚无统一说法。中医药学者认为其发生多因正气虚损,阴阳失调,六淫之邪乘虚而入,导致肺脏功能失调,宣降失司,气机不畅,导致血行受阻,津液失于输布,津聚为痰,痰凝气滞,淤阻脉络,痰气瘀毒胶结日久形成肺肿块。

中肺合剂(也称清肺合剂)是浙江省肿瘤医院治疗中晚期肺癌经验方开发的医院制剂。从1984年开始生产。该处方由防己、浙贝、白花蛇舌草等10味中药组方而成,具有清热解毒,软坚散结,活血化瘀之功效。目前主要用于晚期肺癌的治疗和早、中期肺癌的辅助治疗。本课题以小鼠Lewis肺癌移植瘤模型,采用EnVision免疫组化染色法观察中肺合剂对小鼠Lewis肺癌组织survivin、caspase-3表达的影响。为该制剂的进一步研究与开发打下基础。

1材料与方法

1.1细胞株

小鼠Lewis肺癌,由浙江大学药学院药理教研室杨波教授惠赠。

1.2动物

C57BL/6小鼠,SPF级,年龄:4～6周,体重18～22g。购自中科院上海实验动物中心[合格证号:SCXK(沪)-2007-0005],饲养于浙江中医药大学实验动物中心。

1.3 药物

中肺合剂,根据浙江省肿瘤医院中药制剂室提供的处方和制备工艺自制。浓度以投入生药重量计算,成品浓度为0.635g•mL-1,根据给药剂量和给药体积配制成相应浓度;注射用环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)(200mg/瓶,批号:07112221,江苏恒瑞制药有限公司)。

1.4主要试剂

PBS磷酸盐缓冲液(ZLI-9062,北京中杉金桥生物技术有限公司);Survivin兔源单克隆抗体(一抗,批号:A0609,美国Santa Cruz公司),Caspase-3兔源单克隆抗体(一抗,批号:J1107,美国Santa Cruz公司);兔两步法试剂盒(二抗,PV-6001,批号:4587,英国invitrogen公司;DAB显色试剂盒(ZLI9032,20×,批号:457500A,英国invitrogen公司)。

1.5主要仪器

OLYMPUS-CKX41倒置万能显微镜(日本奥林巴斯公司);Leica DMLB光学显微镜(德国Leica公司);STP120脱水机(MICROM公司);AP280-2包埋机(MICROM公司);HM335E切片机(MICROM公司);AB104-N电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);BG-270DRP-9052电热恒温箱(上海森信实验仪器有限公司);GNP-9080隔水式电热恒温箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.6实验方法

1.6.1 模型制备与分组 取接种Lewis 肺癌10～14天的C57BL/6荷瘤小鼠,脱颈椎处死,无菌条件下取瘤组织,按肿瘤质量(g)与生理盐水(mL)1∶3制备瘤细胞悬液,200目细胞筛过滤,1500r/min,5min,用生理盐水调节成浓度约1×107•mL-1肿瘤细胞浓度。取50只小鼠,雌雄各半,在右前腋皮下接种Lewis肺癌瘤细胞悬液,每只0.2mL。并随机分成5组:A组:荷瘤(生理盐水)对照组;B组:中肺合剂低剂量组;C组:中肺合剂中剂量组;D组:中肺合剂高剂量组;E组:环磷酰胺化疗组。

1.6.2 给药方式 本次实验拟定小鼠低、中、高给药剂量(以制备时投入生药计算)分别为12.7g•kg-1•d-1,25.4 g•kg-1•d-1,50.8 g•kg-1•d-1。采用给小鼠灌胃的给药方法,一次灌胃体积为0.4mL,每日1次。配制成相应的低、中、高给药浓度分别是0.635 g•mL-1、1.27g•mL-1、2.54g•mL-1,相当于成品中肺合剂的1倍、2倍、4倍。造模后24 h开始灌胃给药,A组用生理盐水0.4 mL/只,每日1次;B、C、D组以低、中、高剂量灌胃0.4mL/只,每日1次;E组以环磷酰胺腹腔注射,30mg•kg-1,每周2次。共观察12天停药。

1.6.3肿瘤组织石蜡标本的制作 停药次日处死动物,剥离皮下瘤体,用10%中性甲醛固定24h。取肿瘤组织切成小块(横断面厚度0.2cm左右)。二次固定30min(10%中性缓冲福尔马林)后流水冲洗30min。经脱水透明浸腊包埋,制成肿瘤组织石蜡标本。

1.6.4EnVision两步法免疫组化染色 将蜡块用切片机切片,每例蜡块连续切片3张备用,厚度4~5μm。切片经脱蜡水洗高压热修复内源性过氧化物酶的阻断PBS清洗滴加一抗(37℃孵育60min,稀释倍数均为1∶100)PBS清洗滴加二抗(37℃孵育45min)PBS清洗DAB显色复染、透明后封片。

1.6.5结果判定 免疫组化染色采用EnVision法。PBS代替一抗作空白对照,已知阳性片作阳性对照。细胞染色强度明显高于背景,Survivin、Caspase-3表达位于胞浆,呈棕黄色颗粒者为阳性细胞。参照王艳等[1]光镜下半定量评定标准计分。染色强调分数标准为:无着色0分;淡黄色为1分;棕黄色为2分;棕褐色3分。然后选取代表性的区域,计数5个高倍视野(400×)下阳性细胞所占的百分比,无着色细胞为0分;≤10%为1分;11%~50%为2分;51%~75%为3分;>75%为4分。两项得分相乘:0~3分为阴性表达“-”;大于3分为阳性表达“+”。

1.6.6统计学处理 运用SPSS 16.0软件对相关数据进行统计学处理。计量资料采用±s表示,两组间计量资料比较采用t检验,两组间率的比较采用χ2检验(Fisher’s精确检验)。

2结果

2.1 中肺合剂对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织survivin蛋白表达的影响

各组survivin阳性细胞数量及表达强弱不一。生理盐水组阳性表达率为90%,阳性细胞数量多而密,细胞着色深,以棕褐色为主,阳性信号表达强;CTX化疗组阳性表达率分别为20%,阳性细胞数量最少,细胞着以无色和淡黄色为主,阳性信号表达弱;低剂量组阳性表达率为70%,阳性细胞数量较多,细胞着以棕褐色、棕黄色占多,阳性信号表达较强;中剂量组阳性表达率分别为40%,阳性细胞数量中等,细胞着色以淡黄色为主,阳性信号表达较弱。高剂量组阳性表达率为50%,阳性细胞数量较多,细胞着以棕黄色和淡黄色居多。具体结果见表1和插页Ⅱ图1。与生理盐水组积分相比,中、高剂量组和化疗组有非常显著差异(P0.05)。

表1中肺合剂对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织Survivin/Caspase-3蛋白表达的影响

组别剂量动物数(n)Survivin

积分阳性率%

Caspase-3

积分阳性率%

NS组20mL•kg-1107.8±3.48901.3±1.4120

低剂量组12.7g•kg-1105.3±2.57702.4±2.0530

中剂量组25.4g•kg-1102.7±2.05**405.4±2.65**70

高剂量组50.8g•kg-1103.6±2.57**502.6±1.20*40

CTX组30mg•kg-1101.6±1.49**207.8±2.89**90

注:与生理盐水组相比*P

2.2中肺合剂对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织caspase-3蛋白表达的影响

各组caspase-3阳性细胞数量及表达强弱不一。生理盐水组阳性表达率为20%,细胞无着色或淡黄色,阳性信号表达弱;CTX化疗组阳性表达率为90%,细胞着色深,以棕褐色为主,阳性信号表达强;低剂量组阳性表达率为30%,阳性细胞数量较少,细胞着色以无着色或淡黄色为主,阳性信号表达较弱;中剂量组阳性表达率分别为70%,阳性细胞数量多,细胞着较深,以棕褐色、棕黄色为主,阳性信号表达较强;高剂量组阳性表达率为40%,阳性细胞数量较少,细胞着以棕黄色为主,阳性信号表达较弱。具体结果见表1和插页Ⅱ图2。与生理盐水组积分相比,中剂量组和化疗组有非常显著差异(P

3分析与讨论

多细胞生物的细胞死亡有两种方式,即细胞坏死和细胞凋亡。细胞坏死是细胞病理性死亡过程,细胞凋亡则不同,是细胞对周围环境中一些信号的主动反应,是体内细胞生理性死亡最常见的形式。

Survivin是1997年由耶鲁大学的Altieri等[2-3]用效应细胞蛋白酶受体cDNA在人体基因组库的杂交筛选中分离出来的一种结构独特的哺乳类凋亡抑制蛋白(inhibition apoptoaisi protein, IAP),由142个氨基酸组成,为IAP家族中最小的1个成员。Survivin具有抑制细胞凋亡和促进细胞分裂的功能,是目前发现的最强的凋亡抑制因子。也是目前发现的惟一与细胞周期密切相关的IAP家族成员。它抑制凋亡的作用主要通过BIR重复序列来完成,作用于凋亡途径上游的启动因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)以及最下游的效应分子Caspase-3和Caspase-7,从而抑制Caspase依赖的细胞凋亡途径[4]。Survivin 也可通过置换p21-CDK4 复合体中的p21,使p21与线粒体Caspase-3结合,间接抑制Caspase活性,从而阻断细胞的凋亡过程[5]。还可通过促进细胞分裂而抑制细胞凋亡[6]。Survivin在人类胚胎发育组织和绝大多数肿瘤组织中均有表达(除、胸腺和胎盘外),在分化正常的组织中不表达,与肿瘤的发生发展和预后密切相关[7-8]。Survivin是一个细胞周期调节基因,其表达与细胞周期密切相关,半衰期仅30min,在细胞周期的G2-M期表达,随后的G1期mRNA和蛋白质水平快速下降。同时,BIR结构区域氨基酸残基变异及N-C端断裂。在体外将Hela细胞阻断在G1期、S期、G2-M期,检测细胞内源性Survivin mRNA的表达,发现在G1期不表达,在S期增加6～7倍,在G2-M期表达上调40倍[9]。Survivin在肿瘤细胞中表达越强,其对癌细胞的凋亡抑制能力越强,肿瘤的恶性程度也随之增高,癌细胞更容易侵袭周围组织而发生转移[10]。

凋亡障碍是肿瘤得以发生和发展的重要因素之一,多种基因和蛋白质均可介导多种细胞生物学效应,其中包括细胞的分化、增殖和凋亡等[11]。在多种细胞的信号转导中,Caspases为一组在细胞凋亡中起重要作用的同源蛋白,能在天冬氨酸之后切割蛋白,对细胞凋亡起着关键作用[12]。迄今Caspases酶家族现已发现14 种以上家族成员,但并不是所有Caspases都参与细胞凋亡反应[13],只有Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7是引起细胞凋亡的具体执行酶[14],其中Caspase-3在细胞凋亡过程中起关键作用,在很多正常细胞或肿瘤细胞中均有表达,是细胞凋亡过程中重要的效应分子。其降解凋亡底物的活性最强,激活的Caspase-3作用于底物PARP(poly-ADP-ribose polymerase),使之发生水解,其水解产物促进细胞骨架降解和DN段化[15]。Caspase-3通常以非活化的酶原形式存在于细胞质中,Caspase-3活化主要有两条途径,一是经细胞表面膜受体如Fas、TNFR1等活化;另一途径是死亡刺激因子作用下,线粒体释放细胞色素C[16]。Caspase-3活化可导致Caspase联级活化,最终导致细胞凋亡。因此,它的活性受到抑制,就会引起细胞凋亡障碍,使细胞凋亡与增殖之间动态平衡失调,并可能进一步引起肿瘤的发生及发展[17]。

从本实验结果看(见表1和插页Ⅱ图1,2),与生理盐水组比较,中肺合剂给药组Survivin表达明显降低,Caspase-3表达明显升高,以中剂量组最明显(P

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