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理肺通络方对肺炎支原体肺炎大鼠肺泡灌洗液中sIgA的干预作用

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【摘要】 目的 观察肺炎支原体肺炎大鼠肺泡灌洗液sIgA的含量及理肺通络方的干预作用。方法 将40只大鼠随机分为正常组、模型组、中药组、西药组,每组10只。一次性滴鼻感染肺炎支原体国际标准株(MPFH)菌液(每毫升含肺炎支原体107变色单位)造成肺炎支原体肺炎模型。造模第11 d起,除正常组外,其余各组分别灌服生理盐水、理肺通络方水煎剂、阿齐霉素溶液,2 mL/只。中药组连续服药10 d,西药组前、后3 d灌药液,中间4 d灌生理盐水。在治疗的第11 d处死动物,观察各组大鼠血清MP\|IgM滴度及右肺组织形态学,采用放免双抗夹心法检测sIgA含量。结果 模型组大鼠血清MP\|IgM阳性,光镜下显示肺组织炎性细胞浸润和组织损伤明显;与正常组比较,模型组、中药组、西药组肺泡灌洗液中sIgA含量显著降低,有高度统计意义(P<0.01);与模型组比较,中药组、西药组sIgA含量显著升高(P <0.01);中药组与西药组比较有统计意义(P<0.05)。结论 肺炎支原体肺炎大鼠肺泡灌洗液sIgA含量下降,理肺通络合剂能提高呼吸道局部sIgA含量,且优于西药阿齐霉素,可能有助于降低再次感染的几率。

【关键词】 肺炎支原体肺炎;理肺通络方;肺泡灌洗液;分泌型IgA

分泌型免疫球蛋白A(sIgA)广泛存在于血液及各种分泌液中,它是分泌液重要的免疫蛋白种类,是机体特异性的防御因素。本实验观察了理肺通络方对肺炎支原体肺炎大鼠肺泡洗液siga含量影响,探讨本方对于增加sIgA含量、提高气道局部防御功能方面的作用。

1 材料及方法

1.1 材料选择6周龄SPF级雄性Wistar大鼠40只,质量(150±10)g,由湖北省疾控中心提供[许可证号:SCXK(鄂)2003-0005],颗粒饲料喂养。理肺通络方由黄芪20 g、沙参10 g、紫菀10 g、枳实10 g、百部10 g、麻黄7 g、杏仁10 g、蜈蚣1条、甘草6 g组成,由湖北省中医医院中药房煎煮成浓度为3 g/mL药液,高压灭菌后置冰箱中备用;阿齐霉素临用前配成5.5 mg/mL溶液[按50 mg/(kg·d)计算];sIgA放免试剂盒(北京北方生物技术研究所提供);肺炎支原体抗体被动凝集诊断试剂盒(富士瑞必欧株式会社提供);GL-20G-Ⅱ冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂生产);WKYⅢ型微量移液器(上海荣泰生化工程有限公司生产)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及样本处理40只大鼠随机分为4组:正常组、模型组、中药组、西药组,每组10只。经3 d适应性饲养后,用乙醚麻醉动物,模型组、中药组及西药组一次性滴鼻感染肺炎支原体国际标准株(MPFH)菌液(每毫升含肺炎支原体107变色单位)0.3 mL/只,正常组予生理盐水0.3 mL/只滴鼻。造模第11 d起,分别灌胃灌服生理盐水、理肺通络方水煎剂、阿齐霉素溶液,2 mL/只。模型组、中药组连续灌胃10 d;西药组前、后3 d灌服药液,中间4 d灌服生理盐水。在治疗的第11 d处死动物,摘眼球取血,检测正常组、模型组血清MP|IgM。暴露大鼠胸腔,结扎右肺,左肺用生理盐水2 mL行肺泡灌洗,灌洗液置-70 ℃冰箱中备用,检测各组sIgA含量。取肉眼可见病变的右下叶肺组织,用10 %福尔马林固定、石蜡包埋、切片、HE染色,光学显微镜下观察。

1.2.2 肺泡灌洗液sIgA 检测本试剂盒采用放免双抗夹心法,可检测血清及各种分泌液中的sIgA。采用的双抗体均是针对sIgA中分泌成分SC的特异抗体。包被在聚苯乙烯球上的抗体与样本中的sIgA形成免疫复合物“抗体-sIgA”,然后加入标记抗体125I-抗体,形成三层夹心免疫复合物“抗体-sIgA-125I-抗体”。测定每个小球上的125I 放射性计数率(cpm)值,与标准曲线或标准值cpm对照计算,即可知样品中sIgA含量。检测操作步骤首先对样品进行1∶10稀释,具体步骤见表1。表1sIgA放射免疫操作步骤 各管cpm值先减去S0 cpm值后再计算,用双对数直角坐标作图(横坐标为浓度,纵坐标为cpm值),查出浓度应乘以稀释倍数即为原标本浓度。

1.2.3 统计学处理所有测定指标均采用±s表示,组间比较采用t检验,以P<0.05、P<0.01表示有统计意义。

2 实验结果

2.1 大鼠血清Mp|IgM滴度及肺组织形态学检查实验结果显示,模型组大鼠血清MP|IgM 滴度显著增高(见表2)。光镜下HE染色,正常组肺组织仅个别大鼠小支气管有少数淋巴样细胞浸润;模型组可见肺泡间隔增宽,支气管、细支气管周围与肺泡间隔内毛细血管明显充盈,有程度不等的淋巴样细胞,个别单核细胞及分叶核白细胞浸润,间质呈明显的炎性改变(见图1、图2)。以上结果说明造模成功。表2大鼠不同稀释倍数血清MP|IgM滴度阳性例数肺泡壁未见增厚,肺泡腔内未见炎性渗出物。肺内小支气管及间质小血管周围未见明显炎性病变。图2 光镜下模型组肺组织形态学观察×200

增宽的肺泡间隔内毛细血管明显充盈,可见程度不等的淋巴样细胞,个别单核细胞及分叶核白细胞浸润,间质呈明显的炎性改变。

2.2 各组大鼠肺泡灌洗液sIgA的含量比较实验结果显示,与正常组比较,模型组、中药组、西药组肺泡灌洗液sIgA含量显著降低,有高度统计意义(P<0.01)。与模型组比较,中药组、西药组sIgA含量显著升高(P <0.01),说明理肺通络合剂和阿齐霉素均可不同程度地提高呼吸道局部sIgA含量;中药组与西药组比较有统计意义(P<0.05),提示理肺通络合剂对于提高sIgA含量方面作用优于阿齐霉素。见表3。 表3各组大鼠肺泡灌洗液sIgA的含量比较注: 与正常组比较#P<0.01;与模型组比较P <0.01;与中药组比较P <0.05

3 讨论

肺炎支原体(MP)是呼吸道常见致病菌,主要通过飞沫或气溶胶传播, MP侵入呼吸道后,首先黏附于膜上皮细胞,然后进入上皮细胞之间,借菌体所产生的过氧化氢酶与菌膜毒性成分引起细胞损伤,致上皮细胞病变及纤毛运动减弱。MP感染后可产生血清特异性IgM、IgG、IgA,但体液抗体保护作用不完全,而呼吸道局部产生的sIgA对防止再感染有较强的作用。sIgA由黏膜固有层的浆细胞产生,在防御、廓清MP感染的过程中起着十分重要的作用[1]。由于外分泌液中sIgA含量多,又不易被蛋白酶破坏,故成为机体抗感染、抗过敏的一道重要的免疫“屏障”。sIgA可阻止病原微生物黏附于黏膜上皮细胞,其机制:一是使病原微生物发生凝集,因丧失活动能力而不能黏附于黏膜上皮细胞;二是与微生物结合后,阻断了微生物表面的特异结合点,因而丧失黏附能力;三是与病原微生物结合,可刺激呼吸道等黏膜中的杯状细胞分泌大量黏液,“冲洗”黏膜上皮,妨碍微生物黏附。此外,sIgA还有免疫排除作用。气道sIgA对于空气中吸入的某些抗原物质具有封闭作用,使这些抗原游离于分泌物,易于被排除,或将抗原物质限制于黏膜表面,不致进入机体,从而避免超敏反应的发生[2]。祖国医学认为,正气是对人体的精、气、神及在此基础上产生的抗病能力、康复能力和自身调控能力的总称。在人体与疾病的正邪斗争中,正气的强弱起着决定性的作用。所谓“正气存内,邪不可干”,“邪之所凑,其气必虚”。有报道[3]指出,肺气虚患者,肺泡灌洗液中sIgA含量较正常人降低,说明肺气虚证患者局部体液免疫处于低下状态,sIgA含量的高低可直接反应呼吸道局部的防卫功能状态。由此可推论sIgA是可以反应人体正气强弱的指标之一。理肺通络方以扶正祛邪、理肺通络为组方原则。通过扶助正气、减轻感染后的症状及病理损伤,促进康复,防止其向其他疾病演变,这是理肺通络方对肺炎支原体肺炎模型的防治作用的机理之一。方中重用黄芪以补脾肺之气,现代药理学也证明,黄芪具有免疫双向调节作用[4];沙参养肺阴,扶正以祛邪;枳实行气化痰;紫菀下气止咳;麻黄、杏仁宣肺平喘;百部杀虫润肺止咳;蜈蚣活血搜风止痉。诸药合用,共奏理肺通络之功效。本实验结果显示,理肺通络方能有效地提高气道sIgA水平,且作用优于阿齐霉素,表明理肺通络方能提高局部防御功能,对于清除支原体寄居和防止再次感染有重要意义。

【参考文献】

[1]贾飞勇,梁东,傅文永,等. 肺炎支原体P1蛋白预防动物支原体肺炎的研究[J]. 中华儿科杂志,2001,39(5):293-294.

[2]龚非力.医学免疫学[M].北京:科学出版社,2000:39.

[3]刘中本,吴华强,赵江云,等.肺气虚患者体液免疫变化的研究[J].中国医药学报,1994,9(4):28-29.

[4]林海清,宋钦兰.黄芪药理作用研究进展[J].山东中医学院学报,1994,18(6):426-427.