猪MBF1基因的多态性及与生产性状的关联分析

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摘要：分x克隆了猪mbf1基因第4外显子的序列，测序发现在18 bp处存在T/C突变，引起TaqI酶切多态。利用PCR-RFLP方法对国内外4个猪种MBF1基因第4外显子的多态性进行分析发现，在国外猪种中等位基因T的的频率占优势；在种中C等位基因的频率占优势；在437头大梅F2代资源家系中进行性状关联分析发现该多态与瘦肉率、板油重、肩部背膘厚、眼肌高、眼肌宽、眼肌面积显著相关（P

关键词：猪MBF1基因；PCR-PFLP；多态性；性状关联分析

中图分类号：S828.8+9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）23-6192-03

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.23.048

Abstract： Cloning and Sequencing of the 4th exon of porcine MBF1 gene indicated that a T18C substitution which can be detected by restriction endonuclease TaqI. This polymorphism was analyzed with PCR-RFLP among four foreign and Chinese pig breeds. Analysis result showed that allele T was predominant in foreign pig breeds；however allele C was predominant in Chinese pig breeds. Statistical analysis in 437 Large White×Meishan F2 progeny pigs showed that the TaqI polymorphism was associated with lean meat percentage，leaf fat weigh，shoulder fat thickness，loin eye height，loin eye width，loin eye area，significantly（P

Key words： porcine MBF1 gene； PCR-RFLP； polymorphism； association analysis

多蛋白桥梁因子（Multiprotein bridging factor 1， MBF1）是一种核受体辅激活因子，它通过桥连通用转录因子TBP增强特异性转录因子的DNA结合活性，增强结合的靶基因的启动子活性，介导靶基因的转录激活，调节生物体的各种生命活动[1-3]。MBF1是一个高度保守的调节内皮细胞分化、中枢神经系统发育、脂类和组氨酸新陈代谢的转录辅激活蛋白[4，5]，同时可以调节类固醇激素的生成[6]。MBF1还可以增强一些与脂类代谢相关的核受体转录激活，调节脂质的动态代谢平衡[4]。

1 材料与方法

1.1 动物和组织样品

基因克隆及SNP筛选的样品：大白猪（湖北省农科院畜牧兽医研究所原种猪场）、梅山猪（英山县绿源养猪专业合作社）二月龄肌肉组织提取RNA。

用于基因频率分析的样品：大白猪（湖北省农科院畜牧兽医研究所原种猪场）、长白猪（华中农业大学试验猪场）、梅山猪（英山县绿源养猪专业合作社）、通城猪（通城县种猪场）共143头，前腔静脉采血，提取DNA。

用于性状关联分析的样品：大白猪和梅山猪杂交产生的F2代群体（华中农业大学试验猪场）437头，分别提取个体DNA并做好性状记录。

DNA的提取：采用传统的苯酚/氯仿提取法。

RNA的提取：按照Invitrogen公司的TRIzol试剂盒说明书进行提取。

1.2 引物及主要试剂

根据大白猪MBF1基因序列，设计猪的第4外显子的特异引物Primer pair，引物序列如下：

Forward primer：GAACAAACAGCACTCAATCAC

Reverse primer：TTCAGGAGCATGTGCCTA

引物由上海生工生物技术有限公司合成，去离子水溶解，-20 ℃保存。pMD-18T vector system、DH5α购自TaKaRa公司（大连）；Gel Extraction Kit购自上海生工生物技术有限公司。

1.3 PCR扩增与克隆、测序

PCR扩增体积为25 μL，体系中各组分的浓度为50 ng模板DNA、1×PCRmix、0.5 mmol/L PCR primers，PCR的运行程序如下：预变性94 ℃ 4 min； 94 ℃ 45 s，61 ℃ 45 s，72 ℃50 s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。

PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测；将目的带用Gel Extraction Kit试剂盒纯化回收，回收后的PCR产物片段与pMD-18T vector system连接并转化DH5α，克隆子送北京奥科生物技术有限公司测序。

1.4 PCR-RFLP分析

选用TaqI对PCR 产物进行消化，酶切反应总体系为10 μL，其中PCR 扩增产物5 μL，限制性内切酶0.5 μL（10 U/μL），10×Buffer 1 μL，ddH2O 3.5 μL，65 ℃恒温反应4 h，后经1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析。

1.5 统计分析

用Qiao等[7]介绍的单标记回归统计模型，使用SAS统计软件（SAS Institute Inc，Version 8.0）的GLM程序进行单标记方差分析，同时用REG程序计算基因的显性效应和加性效应，并进行显著性检验。加性效应用-1，0和1分别代表TT、TC和CC基因型，显性效应用1，-1和1分别代表TT、TC和CC基因型。所采用模型为：Yijk=μ+Si+Yj+Gk+bijkXijk+eijk，其中Yijk为性状表型值，μ为群体均值，Si为性别效应，Yj 是年份效应，Gk为基因型效应，bijk为屠宰体重的回归系数，Xijk是协变量屠宰体重，eijk为残差效应。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增产物

Primer pair分别在大白猪、梅山中扩增，取扩增产物5 μL在1%的琼脂糖上电泳，其大小为760 bp，与GenBank上公布的猪MBF1基因的序列大小相一致（图1）。PCR产物测序，结果发现在第4外显子18 bp处有1个T-C突变（图2），引起TaqI酶切（T，CGA）多态。

2.2 扩增产物的PCR-RFLP分析

该位点经限制性内切酶TaqI酶切分析发现：当第4外显子18 bp处的碱基为C时TaqI酶切该位点，记为CC型（354 bp+325 bp+81 bp），当该位点碱基都为T时TaqI不识别该位点，记为TT型（679 bp+81 bp），当C和T都存在时记为CT型（679 bp+354 bp+325 bp+81 bp）。猪MBF1基因的PCR- TaqI-RFLP的酶切分型结果如图3。

2.3 猪MBF1基因TaqI位点在不同猪种中的基因频率和基因型频率

在中外4个品种猪中检测MBF1基因第4外显子PCR-TaqI-RFLP多态性基因频率分布，检测结果如表1所示。在国外猪种中等位基因T的的频率占优势，大白、长白猪T等位基因的频率分别为0.81和0.86；而在种中C等位基因的频率占优势，在梅山和通城猪中C等位基因的频率分别为0.94和0.71。

2.4 猪MBF1基因TaqI位点基因型与生产性状的关联分析

应用SAS软件运行GLM和REG程序，进行猪MBF1基因PCR-TaqI-RFLP不同基因型与猪生产性状的关联分析和遗传效应估计，基因型检测结果表明：在所检测的437头大白×梅山F2代个体中，TT基因型134头，CT基因型204头，CC基因型99头。不同基因型与生产性状间的统计结果见表2。

统计结果显示，MBF1基因第4外显子PCR-TaqI-RFLP多态性与瘦肉率、板油重、肩部背膘厚、眼肌高、眼肌宽、眼肌面积显著相关（P

3 讨论

本研究中，TT基因型有较高的瘦肉率、眼肌高、眼肌和眼肌面积；瘦肉猪品种大白猪、长白猪群体中T基因频率占优势，在中国本地品种梅山猪、通城猪中C等位基因占优势，说明T基因可能具有提高瘦肉率，降低背膘厚的效应；而C基因可能具有促进脂肪沉积降低瘦肉率的效应。

瘦肉率、肩部背膘厚、眼肌面积、眼肌高加性效应显著，加性效应是可以遗传的，因此可以采用分子标记辅助选择和常规选择项结合的方法对猪屠宰率、背膘厚、眼肌面积等性状进行固定。显性效应主要基因互作的结果，显性效应性状可通过杂交获得较好选择效果[8]。

MBF1是调节脂类和组氨酸等代谢的转录激活蛋白，可以调节类固醇激素的生成，调控脂肪代谢动态平衡[4-6]，为MBF1基因作为调节脂肪沉积性状的候选基因提供了生理功能依据。本研究证实了MBF1基因第4外显子T/C突变与瘦肉率、背膘厚等脂肪沉积相关性状存在显著的相关性，为该因作为调节脂肪沉积性状的候选基因提供了统计学依据，综上所述，MBF1基因可以作为猪脂肪沉积性状的候选基因。

参考文献：

[1] TAKEMARU K，LI F Q，UEDA H，et al.Multiprotein bridging factor 1（MBF1） is an evolutionarily conserved transcriptional coactivator that connects regulatory factor and TATA element-binding protein[J].Proc Natl Acad Sci，1997，94：7251-7256.

[2] TAKEMARU K，HARASHIMA S，UEDA H，et al.Yeast coactivator MBF1 mediates GCN4-dependent transcriptional activation [J].Mol Cell Bio，1998，18：4971-4976.

[3] OZAKI J，TAKEMARU K，IKEGAMI T，et al.Identification of the core domain and the secondary structure of the transcriptional coactivator MBF1[J].Genes Cells，1999，4：415-424.

[4] BRENDEL C，GELMAN L，AUWERX J. Multiprotein bridging factor 1（MBF1） is coactivator for nuclear receptors that regulate lipid metabolism[J].Mol Endocrinol，2002，16：1367-1377.

[5] LIU Q X，JINDRA M，UEDA H，et al.Drosophila MBF1 is coactivator for tracheae defective and contributes to the formation of tracheal and nervous system[J].Development，2003，130： 729-728.

[6] KABE Y，GOTO M，SHIMA D，et al. The role of human MBF1 as a transcriptional coactivator[J].J Bio Chem，1999，274：34196-34202.

[7] QIAO M，WU H Y，LI F，et al.Molecular characterization，expression profile and association analysis with carcass traits of porcine LCAT gene[J].Molecular Biology Reports，2010，37（5）：2227-2234.

[8] 武华玉，乔 木，黄京书.猪USF1基因的多态性及与生产性状的关联分析[J].湖北农业科学，2014，53（24）：6064-6067.