药用植物毛状根的诱导及其应用
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[摘要] 植物毛状根培养是植物组织培养中的一种，因其不仅克服了植物生长缓慢、有效成分积累有限的不足，且具有不依赖外源植物激素等优点，近年来研究较多。文章介绍了目前药用植物毛状根的诱导情况，并总结了植物毛状根培养体系在次生代谢物的生产、生物合成机制及调控基因的研究、植物基因工程、生物转化以及药物蛋白中的应用，旨在为其他药用植物毛状根的培养及利用提供参考依据。
[关键词] 毛状根； 药用植物； 次生代谢产物； 发根农杆菌； 生物转化
[收稿日期] 2013-11-30
[基金项目] 全国优秀博士学位论文作者专项资金项目（201188）；首都中医药研究专项（13ZY03）；北京市优秀人才培养个人项目（2011D005018000002）
[通信作者] 王秀娟，教授，研究方向为中药药效与作用机制及中药资源可持续利用，Tel：（010）83911624，E-mail：
[作者简介] 张萌，硕士研究生，E-mail：
植物毛状根培养是植物组织培养中的一种，因其生长不依赖外源植物激素、合成次生代谢物能力强且稳定、具有生物转化功能以及繁殖能力强等优点，可以在医药领域用于生产药物，近年来受到众多学者的关注。目前已经有近百种药用植物成功诱导出毛状根，并广泛应用于多种研究之中。本研究介绍了目前药用植物毛状根的诱导情况并总结了植物毛状根应用现状，为其进一步研究和利用提供参考。
1 药用植物毛状根的诱导
1.1 毛状根的发根机制
毛状根（hairy roots）是发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes感染植物后，在植株创伤表面诱导产生的一种特殊表现型。早在1907年，Smith和Townsend就发现发根农杆菌能够诱导植物产生毛状根，此后，学者们发现无论是发根农杆菌还是根癌农杆菌A. tumefaciens，其致病原因均是由大分子质粒引起的[1-2]，但发根农杆菌的致病质粒与其他Ti质粒（根瘤诱导质粒）功能既有差异又有联系[3]。直到1982年，美国科学家Chilton[4]发表文章阐述其发根机制：发根农杆菌中Ri质粒上T-DNA进入宿主植物细胞引发了毛状根的产生。
Ri质粒是发根农杆菌染色体外的一个约250 kb的大质粒，其上面存在2个与转化有关的功能区，即T-DNA（转移区）和Vir（致病区）。T-DNA的主要功能是在转化时进入植物细胞并插入到寄主植物基因组中，表达决定毛状根生长和冠瘿碱合成的基因；Vir区的作用是协助T-DNA区完成转化。Vir区上有7个操纵子 VirA-G，转化时，植物伤口产生小分子酚类化合物与VirA的表达产物结合，激活其他Vir基因，使T-DNA被剪切、转移并最终整合到宿主细胞基因组中。因此，单子叶植物不能合成特异性小分子酚类化合物是其难以被侵染诱导出毛状根的主要原因[5-7]。
1.2 药用植物毛状根诱导情况
目前，已有近百种药用植物成功诱导出毛状根，总结发现其中76%为草本植物，也有少量藤本及木本植物，比例分别占到7%，17%；在植物学分类方面，已诱导出毛状根的药用植物科属分类较为分散，其中豆科、茄科、菊科和唇形科占有相对较大的比例（表1）。
自20世纪90年代起，一些学者就开始致力于研究药用植物毛状根，发根农杆菌作为影响毛状根诱导的主要因素也一直备受关注。目前，诱导药用植物毛状根的常用菌株有A4，ATCC15834，R1601，LBA9402，R1000，C58C1，1.2556，R1600，ACCC10060等，在已诱导出毛状根的药用植物中，27%使用的是A4菌株，20%使用发根农杆菌ATCC15834，14%使用R1601，其余菌株的使用均在10%以内，不同植物对于不同菌株的敏感性差异较大。部分学者利用农杆菌ATCC15834，C58C1，A4，R1601等诱导出木本或藤本药用植物的毛状根，例如杜仲[8]，绞股蓝[9]，南方红豆杉[10]等，但在菌株选择上依然很盲目，需要进一步探索其规律。
2 应用
2.1 在次生代谢物生产中的应用
毛状根因其遗传性状稳定、生物合成能力强等诸多优点，比悬浮细胞更适合用于次生代谢物的生产。利用发根农杆菌诱导的毛状根生产次生代谢产物，其含量比原植物药高，如通过杜仲毛状根的培养来获得桃叶珊瑚苷药用成分，其质量分数最高可达30.105 mg・g-1，且高于自然根及皮，高产根系E1进行大规模繁殖培养能获得理想的药用物质，有望替代传统药源[8]。
很多研究都显示，适当的改变培养条件，如培养基和碳源的选择、外源激素添加及配比，以及不同诱导子的加入，均可以有效地提高次生代谢物产量。研究发现金铁锁毛状根在1/2MS培养基中皂苷的总产量最大[11]。丹参毛状根培养基中葡萄糖浓度的增加能够规律的促进丹参毛状根中迷迭香酸、丹酚酸B等的产生和积累，且其促进作用大于蔗糖[12]。也有学者发现，葡萄糖和蔗糖对阿拉伯芥毛状根中萜类和甾醇类成分的影响与糖信号参与调控顺式异戊烯基转移酶和植物甾醇途径酶有关[13]。
在培养基中加入不同的细胞分裂素或生长激素，也会对毛状根的生长及次生代谢产物的积累发生作用。研究发现，单用或组合应用6-BA时，会对毛状根的生长有抑制作用，但对一些次生代谢产物有显著促进作用，NAA，IAA，IBA单用或组合应用可促进某些次生代谢产物的积累[14-16]，2，4-D可明显提高白芥毛状根中芥子油苷的含量，但KT对该成分没有影响[17]。而诱导子的加入可以对某一类次生代谢产物特异调节，单独或组合使用可以达到调控代谢的目的。如生物诱导子酵母提取物，可显著促进牛角瓜中强心苷[18]、甘草中总黄酮[19]的合成；非生物诱导子Ag+可使水飞蓟毛状根中水飞蓟素的含量明显提高[20]。
2.2 在次生代谢物生物合成机制及其调控基因研究中的应用
药用植物功能基因研究是从功能基因入手阐明药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制，其中主要涉及到次生代谢产物生物调控关键酶的结构编码基因和其他功能基因。近年来，不少学者以毛状根为研究材料发现了很多新的功能基因，并阐明了一些次生代谢产物的调控机制。
王学勇[21]等从丹参毛状根中克隆得到了丹参4-（5′-二磷酸胞苷）-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶（简称为SmCMK）编码基因的全长cDNA序列（GenBank注册号EF534309），并初步证明了SmCMK基因表达量与丹参酮类成分的积累之间呈正相关趋势。崔光红等[22]获得了一系列与次生代谢相关基因如细胞色素P450、二萜合酶等基因片段，为深入开展丹参功能基因组学研究奠定了基础。也有文献报道从丹参毛状根中克隆获得2-C-甲基-D-赤藓糖醇2，4-环焦磷酸合成酶（SmMCS）全长基因[23]、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR3）基因[24]、丹参乙烯应答因子结合蛋白（ERF）基因[25]，丙二烯氧化物环化基因SmAOC（GenBank注册号HM156740）[26]、柯巴基焦磷酸合酶cDNA全长基因（SmCPS）[27]等，为进一步研究丹参次生代谢途径提供了新的思路和靶点。有学者研究丹参酮生物合成途径时发现：外源性PEG和ABA通过激发内源性MJ的分泌而促进丹参酮产量增加[28]；同时丹参毛状根的生长及丹参酮类成分的积累均受MVA和MEP途径的影响，但毛状根的生长主要受MEP途径的影响，丹参酮类化合物的积累主要受MVA途径的影响[29]。
2.3 在植物基因工程中的应用
在各种遗传转化方法中，农杆菌是自然界存在的天然基因工程载体，具有许多优点，在药用植物功能基因研究的基础上，发根农杆菌及毛状根培养在植物生物技术中的应用越来越广泛，很多学者利用Ri质粒介导外源基因，进行毛状根诱导表达，使得毛状根培养体系中目标有效成分产量得到大幅提高，如桔梗毛状根中甾醇和三萜类成分[30]、甘草中甘草酸[31]、三分三中莨菪烷型生物碱[32]等，为工业生产奠定了基础。有研究将透明颤菌血红蛋白基因（vgb）及颗粒结合型淀粉合成酶基因（GBSS）分别导入黄芩毛状根中，结果显示黄芪甲苷含量是非转基因黄芪毛状根的5～6倍，是山西产黄芪药材的10～12倍[33-35]。
此外，也有研究利用诱导出的转基因毛状根进行植株再生，以获得优良的转基因植物。例如转基因苜蓿毛状根植株表型Ⅱ高产并质优，表现为茎杆数多、叶多，对苜蓿育种和生产具有重大意义[36]。
2.4 在生物转化中的应用
毛状根培养体系内的酶系统较为复杂，可以发生羟基化、糖基化、葡糖化、氧化还原、氢化、水解、甲基化、乙酰化、异构化和酯化等多种生物反应[37]，若向其中投入不同的底物，可经过多种反应进行结构修饰，最终获得或产量更高、或活性更好、或毒性更小天然活性化合物，药用植物毛状根生物转化体系为生产新的药物前体提供了可能。目前已经有多种药用植物毛状根作为生物转化体系被深入研究。
2.4.1 人参 早在20世纪90年代初，就有学者利用人参毛状根进行生物转化，将毛地黄毒苷配基作为底物投入到人参毛状根培养体系，结果发生了多种反应并获得了5种酯化产物以及6种糖苷化产物[38]。此后，对于人参毛状根生物转化作用的研究逐渐深入，有研究发现，在该体系中，对羟基苯甲酸及间羟基苯甲酸可以通过糖苷化、酯化反应转化成为相应的产物，但邻羟基苯甲酸并未发生转化，同时，间羟基苯甲酸的酯化产物间羟基苯甲酸β-D-吡喃木糖（16）-β-D-吡喃葡萄糖酯是一种新的化合物，进一步实时反应进程研究显示，糖苷类是该生物转化的主要产物，而添加碳水化合物和抗氧化剂可以增加糖脂的形成[39]。
2.4.2 何首乌 进入21世纪，学者们关于何首乌毛状根培养体系的生物转化研究层出不穷。有报道发现，向何首乌毛状根培养体系投入青蒿酸，可生成3个青蒿素类化合物和1个羟基化产物[40]；4-甲基-7-烯丙基氧香豆素可以在何首乌毛状根悬浮体系中转化成4-甲基-7-羟基香豆素及4-甲基香豆素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[41]，瑞香素则在该体系中完成生物转化合成天然药材中含量极低的活性化合物――瑞香素-8-O-β-D-葡萄糖苷[42]，严春艳等向该体系投入8种底物，其中呋喃橐吾酮转化成2个新的化合物，对苯二酚转化成熊果苷，青蒿素转化获得2种物质，证明在何首乌毛状根悬浮体系中存在多种生物酶系统，可对外源底物进行糖基化、氧化、还原和羟基化修饰等[43]。
2.4.3 其他药用植物 此外，还有多种药用植物的毛状根培养体系作为生物转化器。毛喉鞘蕊花毛状根培养体系可以将小分子醇类物质如甲醇、乙醇、丙醇葡糖化生成相应的吡喃葡萄糖苷[44]；向紫花曼陀罗毛状根培养体系中添加对羟基苯甲醇，通过生物转化可形成天麻苷，该反应的转化率可以达到59.75%，为工业生产天麻苷提供了一条新的途径[45]；也有研究显示，狭叶红景天毛状根培养体系可以将肉桂醇转化成为络塞维以及络塞琳，这将成为此2种活性物质新的来源[46]。
2.5 在药物蛋白中的应用
目前，转基因植物已经可以表达多种药物蛋白，如疫苗抗体、哺乳动物酶等[47]，其生产成本较微生物发酵方法低，更易于操作，也更安全，受到广泛的关注，但是，转基因植物可能通过异花传粉将基因传给野生型亲源物种，对自然生物环境造成一定威胁。毛状根培养则是通过有丝分裂和细胞分裂稳定的遗传，能够大量均一的表达靶基因产物，成为一种生产药物蛋白的重要方法。近些年，已经有很多植物毛状根培养体系可以成功生产功能蛋白和药物蛋白，例如利用烟草的毛状根培养生产小鼠白介素12[48]，通过转基因马铃薯毛状根表达乙型肝炎病毒表面抗原，其产量最高可达到97.1 ng・g-1，高于马铃薯原植物及试管薯[49]。
同时，与毛状根培养体系生产次生代谢物一样，诱导子的刺激也可使目的蛋白的含量进一步增加，研究发现烟草毛状根可以产生奇甜蛋白，在奇甜蛋白基因氨基末端融合钙网蛋白信号序列后，可使奇甜蛋白分泌到毛状根培养的培养基中，质量浓度达到0.21 mg・L-1，当培养基中添加聚乙烯吡咯烷酮和氯化钠时，奇甜蛋白总量可分别达到1.4，2.63 mg・L-1。
3 展望
发根农杆菌介导的毛状根诱导及培养技术在药用植物次生代谢产物的产量的提高、相关功能蛋白及基因的鉴定、代谢途径及信号分子的识别等多个方面取得很大的进步，其应用领域也愈发广泛。但随着研究的不断深入，还有一些问题亟待解决，如目前农杆菌不同菌株侵染物种能力的差异机制尚不明确；单子叶植物及木本植物毛状根培养体系建立的研究较少；利用毛状根培养体系生产次生代谢产物大多处于实验研究阶段，较少将其作为一种生物反应器应用于工业大规模生产中；毛状根大量培养设备装置成本较高，使毛状根的大规模生产难以推广等，这些都需要研究者进行更深入的探索。
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Medicinal plant hairy roots generating and their applications
ZHANG Meng， GAO Wei， WANG Xiu-juan
（School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100069， China）
[Abstract] As a kind of the plant tissue cultures， hairy root culture is characterized by rapid growth without exogenous hormones source and high yield of secondary metabolites， which attracted the attention of scholars in resent years. This work systematically summarized the research of medicinal plant hairy roots， including the mechanism， current situation of medicinal plant hairy roots， and their applications.
[Key words] hairy root； medicinal plant； secondary metabolite； Agrobacterium rhizogenes； biotransformation
doi：10.4268/cjcmm20141102