七叶胆苷ⅩⅤⅡ大鼠体内药代动力学研究

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[摘要] 应用高效液相色谱-质谱联用分析方法，建立七叶胆苷ⅩⅤⅡ体内分析方法，方法学结果显示线性范围为1～2 500 μg・L-1（r=0.996 3）；高、中、低3种不同浓度的日内RSD分别为9.9%，3.0%，1.7%；日间RSD分别为16%，14%，2.5%；基质效应90.0%～100%，RSD80.0%。对大鼠静脉和灌胃给予七叶胆苷ⅩⅤⅡ对照品后测定血浆中浓度随时间的动态变化过程，绘制药时曲线，并根据药时曲线计算药代动力学参数。用DAS 2.0软件计算得到七叶胆苷ⅩⅤⅡ在大鼠体内口服药代动力学参数tmax为0.17～0.20 h，t1/2为1.94～2.56 h，生物利用度为1.87%。结果显示七叶胆苷ⅩⅤⅡ药动学特征为口服吸收分布快，达峰时间快，消除快。

[关键词] 七叶胆苷ⅩⅤⅡ； 药代动力学； LC-MS/MS； 血药浓度

[Abstract] In this study， we established an HPLC-MS method to determine gypenoside ⅩⅤⅡ in biosamples. The methodology results indicated that the linear range was 1-2 500 μg・L-1（r=0.996 3）； intraday RSD values for high， medium and low concentrations were 9.9%， 3.0% 1.7%； interday RSD values were 16%， 14%， 2.5%； matrix effect ranged between 90.0%-100%， with RSD

[Key words] pypenoside ⅩⅤⅡ； pharmacokinetics； LC-MS/MS； plasma concentration

三七Panax notoginseng（Burk.） F. H. Chen槲寮涌迫瞬问糁参铮又名田七、金不换等，为我国名贵中药材，产于云南和广西[1]。三七具有活血化瘀、消肿止痛和滋补强壮等功效[2]，主要化学成分为皂苷、黄酮、多炔醇、多糖、氨基酸、肽以及脂肪酸等，其中三萜皂苷类成分是三七制剂的主要有效成分和质控指标[3]。目前对于皂苷的研究大多数集中于三七药材中含量较高的三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Re，人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd等[4-5]。

现代药理学研究表明，三七中含有的一些微量皂苷成分也具有很显著的药理活性。七叶胆苷在体内具有抗肿瘤活性，其可能机制为代谢生成了具有诱导肿瘤细胞凋亡作用的20-O-（β-吡喃葡萄糖基）-20（S）-原人参二醇[6]。据报道，从三七中发现的一种新的植物雌激素七叶胆苷ⅩⅤⅡ属于七叶胆苷类化合物，通过抑制氧化应激，抑制脑缺血导致的神经损伤，进而抑制氧化低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡，其作用机制可能与抑制免疫炎症因子的分泌和自由基清除作用有关，从而起到防止动脉粥样硬化的作用[7]。为了更好地理解七叶胆苷ⅩⅤⅡ的作用机理、作用过程，有必要全面了解其体内动态变化规律。本研究监测七叶胆苷ⅩⅤⅡ大鼠体内血药浓度变化规律，为后期药物安全性评价、临床新药研究提供科学依据。

1 材料

Thermo Ultimate 3000 高效液相色谱仪，Thermo TSQ Vantage，ESI 离子源，XS105 型分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Legend Micro17 微量台式离心机（美国Thermo Finnigan 公司）；Vortex Genie-2 涡旋振荡器（美国Scientific 公司）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声波清洗器）。

七叶胆苷ⅩⅤⅡ对照品（批号130421，纯度>98%）和内标人参皂苷Rg1（批号140809，纯度>95%）购自上海同田生物技术股份有限公司；甲酸（分析纯，中国国药控股有限公司）；乙腈（色谱纯，德国Merck公司）。

雄性/雌性Wistar大鼠，体重（200±20） g，购自北京维通利华有限公司。普通饲料喂养，自由饮水进食，适应性喂养1周。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

Thermo Ultimate 3000 高效液相色谱仪；ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱温 45 ℃；流动相水（A）-乙腈（B），梯度洗脱，0～2 min，10%～50%B，2～3.5 min，50%～90%B，3.5～6 min，90%B，6～6.5 min，90%～10%B，流速0.4 mL・min-1；进样体积10 μL。

质谱参数：Thermo TSQ Vantage三重四级串联质谱仪；ESI离子源；负离子检测模式；离子源参数设置：喷雾电压（spray voltage）3.0 kV；喷雾温度（vaporizer temperature）200 ℃；鞘气流速（sheath gas）40 unit；辅助气流速（aux gas）10 unit；毛细管温度（capillary temperature） 300 ℃；碰撞气（collision gas， argon）1.5 mTorr；质谱扫描模式选择反应监测（SRM）：七叶胆苷ⅩⅤⅡ m/z 945.5/783.8，CE 31 eV；GRg1 m/z 799.5/637.6，CE 24 eV。所有操作以及数据处理由Xcalibur（version 2.2）软件控制。

2.2 给药方案与血样采集

2.2.1 尾静脉给药

12只SD大鼠，实验前禁食12 h，实验期间自由饮水。以2 mg・kg-1经尾静脉注射给予七叶胆苷ⅩⅤⅡ溶液，于给药后5，10，20，40，60，120，180，240，360，480，720 min经眼球后静脉丛采血 0.2 mL，置于涂有肝素的Eppendorf管中，4 000 r・min-1离心 10 min，吸取上层血浆，置于-20 ℃冰箱中保存，待分析。

2.2.2 口服给药

12只SD大鼠，实验前禁食12 h，实验期间自由饮水。以50 mg・kg-1（2.0 mL・kg-1）的剂量口服给予七叶胆苷ⅩⅤⅡ溶液，于给药后5，10，20，40，60，90，120，180，240，360，480，720 min经眼球后静脉丛采血0.2 mL，置于涂有肝素的Eppendorf管中，4 000 r・min-1离心 10 min，吸取上层血浆，置于-20 ℃冰箱中保存，待分析。

2.3 血浆样品预处理

取大鼠血浆样品50 μL，加入内标溶液50 μL，甲醇150 μL，涡旋混合30 s，15 000×g离心10 min，吸取上清液10 μL，进样分析，记录色谱图。此外，由于静注给药后5 min血药浓度超过了仪器的定量上限。因此，将该时间点得到的血浆样品用空白血浆稀释1倍后再按照上述处理方法处理。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性考察

取大鼠空白血浆，除不加内标溶液并补加相应体积的甲醇外，其余按2.3项下操作，获得空白血浆样品色谱图；另取50 μL质量浓度为500 μg・L-1的七叶胆苷ⅩⅤⅡ对照溶液，37 ℃氮气吹干后，加入50 μL空白血浆涡旋混合均匀，其余按2.3项下操作，获得模拟生物样品色谱图；再取静注给予七叶胆苷ⅩⅤⅡ（2.0 mL・kg-1）后60 min血浆样品，按2.3项下操作，获得给药血浆样品色谱图。

2.4.2 线性关系、检测限与定量限试验

精密移取各标准系列溶液50 μL，37 ℃氮气吹干后，加入50 μL空白血浆涡旋混合均匀配制成相当于1，5，10，50，100，500，1 000，2 500 μg・L-1的七叶胆苷ⅩⅤⅡ标准系列溶液，其余按2.3项下操作。以七叶胆苷ⅩⅤⅡ浓度为横坐标（C），七叶胆苷ⅩⅤⅡ与内标峰面积比值为纵坐标（R），以加权（1/x2）最小二乘法进行线性回归运算，得回归方程即为标准曲线。

2.4.3 精密度和准确度试验

按标准曲线配制方法制备含七叶胆苷ⅩⅤⅡ质量浓度分别为5，50，2 000 μg・L-1的质量控制 （QC）样品，每个浓度平行配制5份。取空白血浆50 μL，按2.3项下操作，连续测定3 d，记录色谱图，计算七叶胆苷ⅩⅤⅡ峰面积As和内标峰面积Ai的比值fx，代入当天的标准曲线求得实测浓度及测浓度准确度，计算日内和日间精密度，与配制浓度相比，求得方法的准确度。

2.4.4 提取回收率试验

精密移取各QC标准溶液50 μL置1.5 mL离心管中，37 ℃氮气吹干后加入空白血浆50 μL，涡旋混合均匀后加入200 μL甲醇沉淀蛋白，涡旋混合30 s，15 000×g离心10 min，分取上层清液150 μL，加入内标50 μL，涡旋混合均匀后，吸取10 μL进样分析，记录色谱图，每一浓度平行配制5份，计算各浓度样品和内标的峰面积比值A。

另取空白血浆50 μL，加入甲醇200 μL沉淀蛋白，涡旋混合30 s，15 000×g离心10 min，分取上层清液，得空白血浆上清液。另取各标准溶液50 μL，置1.5 mL离心管中，37 ℃氮气吹干后加入空白血浆上层清液250 μL，涡旋混合均匀后，吸取150 μL加入50 μL内标溶液，涡旋混合均匀后吸取10 μL进样分析，记录色谱图，每一浓度平行配制5份，计算各浓度样品和内标的峰面积比值B。A与B的比值即为七叶胆苷ⅩⅤⅡ的提取回收率。

2.4.5 稳定性试验

2.4.5.1 短期稳定性 精密移取各标准溶液50 μL，37 ℃氮气吹干后加入空白血浆50 μL。配制成相当于七叶胆苷ⅩⅤⅡ质量浓度为5，50，2 000 μg・L-1的QC样品，在室温下放置24 h后按2.3项下操作，每一浓度5个样品，记录相应的色谱图。将七叶胆苷ⅩⅤⅡ与内标峰面积的比值带入随行标曲中计算七叶胆苷ⅩⅤⅡ的实测浓度，计算实测浓度与制备浓度的比值从而求得样品短期稳定性。若比值为85.0%～115%，则认为样本稳定。

2.4.5.2 长期稳定性 精密移取各标准溶液50 μL，37 ℃氮气吹干后加入空白血浆50 μL。配制成相当于七叶胆苷ⅩⅤⅡ质量浓度为5，50，2 000 μg・L-1的QC样品，在-20 ℃冰箱中放置14 d后按2.3项下操作，每一浓度5个样品，记录相应的色谱图。将七叶胆苷ⅩⅤⅡ与内标峰面积的比值带入随行标曲中计算七叶胆苷ⅩⅤⅡ的实测浓度，计算所测浓度与制备浓度的比值从而求得样品的长期稳定性。若比值在85.0%～115%，则认为样本稳定。

2.4.5.3 冻融稳定性 精密移取各标准溶液50 μL，37 ℃氮气吹干后加入空白血浆50 μL。配制成相当于七叶胆苷ⅩⅤⅡ质量浓度为5，50，2 000 μg・L-1的QC样品，置-20 ℃冰箱储存24 h，取出解冻后再置于-20 ℃储存24 h，取出，解冻，再置-20 ℃储存24 h取出解冻后进样分析，记录相应的色谱图。将七叶胆苷ⅩⅤⅡ与内标峰面积的比值带入随行标曲中计算七叶胆苷ⅩⅤⅡ的实测浓度，计算所测浓度与制备浓度的比值从而求得样品的冻融稳定性。若比值在85.0%～115%，则可认为样本稳定。

2.4.5.4 样品在进样器中稳定性 精密移取各标准溶液50 μL，37 ℃氮气吹干后加入空白血浆50 μL。配制成相当于七叶胆苷ⅩⅤⅡ质量浓度为5，50，2 000 μg・L-1的QC样品，按2.3项下操作，在自动进样器中放置8 h后进样分析，每一浓度5个样品，记录相应的色谱图。将七叶胆苷ⅩⅤⅡ与内标峰面积的比值带入随行标曲中计算七叶胆苷ⅩⅤⅡ的实测浓度，计算所测浓度与制备浓度的比值从而求得样品在进样器中的稳定性。若比值在85.0%～115%，则可认为样本稳定。

2.5 基质效应

取空白血浆，按2.3项下操作制备空白血浆上清液适量，备用。精密移取100 μL质量浓度为5，50，2 000 μg・L-1标准溶液于1.5 mL离心管中，以氮气流吹干。残渣以空白血浆上清液100 μL复溶，15 000×g离心10 min，分取上层清液，进行LC-MS分析。记录色谱图，记录七叶胆苷ⅩⅤⅡ峰面积A。

精密移取100 μL质量浓度为5，50，2 000 μg・L-1的标准溶液于1.5 mL离心管中，以氮气流吹干。残渣以蒸馏水100 μL复溶，15 000×g离心10 min，分取上层清液，进行LC-MS分析。记录色谱图和七叶胆苷ⅩⅤⅡ峰面积B，计算基质效应（matrix effect，ME）。ME=A/B×100%。若ME在85.0%～115%，则可认为没有基质效应。

2.6 药动学研究

实验资料采用中国药理学会编写的药代动力学统计软件包DAS 2.0进行非房室模型拟合，计算口服给药的生物利用度（bioavailability，BA）。BA=（AUCpo × Dose iv）/（AUCiv × Dosepo）×100%。

3 结果

3.1 色谱、质谱条件优化

对七叶胆苷ⅩⅤⅡ和内标Rg1进行质谱全扫模式研究。在负离子模式下，七叶胆苷ⅩⅤⅡ能够产生m/z 915.98[M-H]-，对其进行二级质谱分析，其主要碎片为m/z 783.87。因此，选择离子对m/z 945.5/783.94为七叶胆苷ⅩⅤⅡ的SRM定量离子对。同样对内标GRg1也进行相关二级能量等参数优化，m/z 799.90/637.64作为GRg1的SRM定量离子对。在色谱条件优化过程中，选择不同流动相进行相关实验，乙腈作为有机相时峰型较好，分析时间较短，最终选择乙腈作为有机相。

3.2 血浆样品处理方法

比较了有机溶剂沉淀蛋白、液-液萃取法和固相萃取法，固相萃取处理的样品能除掉大部分的盐和干扰物质，但萃取小柱价格昂贵，沉淀蛋白处理的样品操作简单，重复性好，成本最低。因此从经济角度考虑选择沉淀蛋白作为样本处理方法。

3.3 分析方法学验证

3.3.1 系统适用性与专属性试验

空白血浆、空白血浆加标准品以及给药后所得血浆色谱图见图1。结果表明，在该色谱条件下，七叶胆苷ⅩⅤⅡ和内标保留时间分别为3.67，2.51 min，血浆中内源性s质不干扰七叶胆苷ⅩⅤⅡ和内标的测定。

3.3.2 标准曲线与最低定量限

以七叶胆苷ⅩⅤⅡ浓度为横坐标，七叶胆苷ⅩⅤⅡ与内标峰面积比值为纵坐标，以加权最小二乘法进行线性回归运算，得标准曲线方程为R=0.007 07+0.006 11 C，r=0.996 3， weight=1/c/c。标准曲线各个浓度点的准确度在85.0%～115%。结果表明，七叶胆苷ⅩⅤⅡ在1～2 500 μg・L-1线性关系良好。方法检测限（LOD）为0.3 μg・L-1（S/N>3），最低定量限（LLOQ）为1 μg・L-1（S/N>10），表明该方法灵敏度较高，可用于七叶胆苷ⅩⅤⅡ的微量分析。

3.3.3 精密度与准确度

精密度和准确度结果见表1，结果表明，高、中、低3个浓度日内精密度与日间精密度RSD均小于15%，准确度为93.90%～99.41%。

3.3.4 基质效应与提取回收率（绝对回收率）

方法提取回收率结果见表2，结果表明，高、中、低3个浓度提取回收率均符合生物样本的分析要求，且RSD均小于15%，该方法提取回收率较高。基质效应测定结果表明，内源性物质不干扰七叶胆苷ⅩⅤⅡ的测定，ME为90.0%～100%，且RSD小于15%。

3.3.5 样本稳定性

稳定性试验结果表明，七叶胆苷ⅩⅤⅡ在血浆中-20 ℃放置14 d，室温下放置24 h，经过3个冻融

结果表明，所建立的血浆样品分析方法符合有关规定的要求，可以用于七叶胆苷ⅩⅤⅡ体内药代动力学研究。

3.4 动学研究

3.4.1 静脉注射给药后七叶胆苷ⅩⅤⅡ在大鼠体内药动学过程

大鼠静脉注射给予七叶胆苷ⅩⅤⅡ（2 mg・kg-1）后，其体内血药浓度-时间曲线见图2。七叶胆苷ⅩⅤⅡ静脉注射后能够快速从大鼠体内消除，给药后12 h其体内血药浓度基本检测不到（低于LLOQ）。七叶胆苷ⅩⅤⅡ的总体清除率CL为（3.45±1.70） L・kg-1・h-1，其消除半衰期t1/2小于2 h，药动学非房室分析所得药动学参数见表4。

3.4.2 口服给药后七叶胆苷ⅩⅤⅡ在大鼠体内药动学过程

大鼠口服给予七叶胆苷ⅩⅤⅡ后（50 mg・kg-1），其体内血药浓度-时间曲线见图3。

七叶胆苷ⅩⅤⅡ口服给药后能够迅速从胃肠道吸收进入血中，给药后5 min在血中可以检测到七叶胆苷ⅩⅤⅡ，并迅速达到最大血药浓度，达峰时间为0.19 h。口服给药后七叶胆苷ⅩⅤⅡ消除非常快，半衰期较短。口服生物利用度较低，为1.87%，可能是由于其极性大，脂溶性较差，难以透过肠系膜所致。非房室模型分析所得药动学参数见表5。七叶胆苷ⅩⅤⅡ无论静注还是口服，其体内滞留时间均较短，消除较快，半衰期约为2 h，属于短半衰期类药物。同时，体内药动学行为基本不存在性别差异；t1/2，MRT，CL等主要药动学参数无显著性差异。有文献报道[8-9]，原人参二醇型皂苷三七皂苷Fc，人参皂苷Rb1等都属于长半衰期（t1/2>20 h）的化合物，这表明皂苷类化合物半衰期可能与皂苷结构中糖的种类、取代的位点以及糖的数目都有一定关系。

4 结论

本研究建立了测定大鼠血浆中七叶胆苷ⅩⅤⅡ的LC-MS/MS方法，该方法简单、灵敏、快捷，精密度等线性关系良好，可以用于生物样本中七叶胆苷ⅩⅤⅡ的药代动力学研究。这为理解七叶胆苷ⅩⅤⅡ的作用机制、作用过程奠定了基础，为后期药物安全性评价、临床新药研究提供了科学依据。

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