钙蛋白酶对动物肌肉嫩度的影响及营养调控
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摘要：钙蛋白酶是一种重要内源性蛋白酶，广泛存在于肌细胞质中，它在Ca2+的激活下能降解肌原纤维蛋白，从而改善肉品嫩度。在介绍钙蛋白酶结构的基础上，阐述了钙蛋白酶与宰后肌肉嫩度的关系、嫩化肌肉的机制及其营养调控。
关键词：钙蛋白酶；肌肉嫩度；营养调控
中图分类号：S879.2；Q512 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2013）08-0072-02
动物肌肉嫩度是消费者区分肌肉品质的重要指标，Savell等[1]报道尽管牛腰大肌的风味和性与其他部位的牛肉相比都较差，但是消费者却认为牛腰大肌是最有价值的肌肉，因为该肌肉的嫩度最大。Shackelford等[2]报道美国居民为消费嫩度大的肌肉而愿意为此支付额外的费用。通过对宰前或宰后对动物施以营养或非营养手段的处理，以期肌肉的嫩度得以改善。动物宰杀后，肌肉要先后经历老化阶段和成熟阶段，不同动物宰后肌肉老化的程度都相似，但是嫩化的程度和速率的变异非常大，因此它是影响肌肉成熟后嫩度差异的主要原因[3]。随着对肉成熟嫩化的机理的深入研究发现钙蛋白酶（Calpain）是肌纤维蛋白分解的重要内源性酶，钙蛋白酶的活性与肌肉嫩度直接相关。
1 钙蛋白酶结构
肌细胞中的钙蛋白酶主要分布在Z线和肌浆膜附近的细胞质中，根据钙蛋白酶表现半最高活性所需的Ca2+ 浓度的不同，可以将普遍存在的钙蛋白酶分为两种，一种为μ-Calpain激活所需Ca2+浓度为微摩尔级（1～65 μmol/L），另一种为m-Calpain激活所需Ca2+浓度为毫摩尔级（0.25～1.00 μmol/L）。它们都由2大小个亚基组成，其中28 ku小亚基在2种Calpain中是相同的，是单个基因的产物，而80 ku大亚基则是不同基因的产物，在氨基酸序列上有差异，表现在N末端序列长度和Ca2+结合区域的不同，但它们都含有保守的活性位点。μ-Calpain中的大亚基的质量稍大于m-Calpain中大亚基的质量（81 889 u VS 79 900 u）。μ-Calpain和m-Calpain大亚基都包含有4个结构域，从氨基端到羧基端分别编为结构域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。结构域Ⅰ在钙蛋白酶活化后发生自溶而活化，而结构域Ⅱ含有催化活性中心，二者是蛋白酶的活性核心区。
2 宰后肌肉中Calpain活性变化
Veiseth等[4]研究发现，羊肌肉在宰后24、72 h，μ-Calpain的活性比最初分别下降42%和95%，360 h后则无活性，而宰后贮存对m-Calpain则无影响，但作者用5 mol/L的氯化钙溶液处理m-Calpain，发现其发生了自溶且活性随时间的延长出现了与μ-calpain相似的消失规律，因此认为m-Calpain在宰后羊的肌肉细胞中呈无活性状态主要是由于钙离子浓度不能使其发生自溶。另外，Delgado等[5]研究也发现普通羊背最长肌中的μ，m-Calpain在宰后的活性变化，发现μ-Calpain在宰后1、3的活性分别降至宰后的42.6%、19%，而在第10天时已不能检测到μ-Calpain的酪蛋白的水解活性。m-Calpain在宰后3、10 d则分别降至宰后的86%、76%，而酪蛋白水解活性与没有变化。钙蛋白酶活性与动物品种[2]、动物性别[6]、营养水平[7]等因素相关，因此在不同研究中，各研究者得出的钙蛋白酶活性变化速率存在差异。
3 Calpain在宰后肌肉嫩化中的作用
3.1 对Costameres的降解
Costameres是存在于肌细胞中的一些丝状的结构蛋白质，起着连接肌原纤维和肌纤维膜、稳定肌细胞结构的作用。在骨骼肌肌细胞中，位于肌膜附近的肌原纤维在每Ⅰ带水平上都有costameres结构。它主要由vinculin、desmin和dystrophin组成[8]。
Thompson等[9]用体内法和体内法同时研究发现costameres是Calpains的良好底物。Taylor等[10]通过电镜发现，在4 ℃下存放的牛股二头肌（BF）和半膜肌（SM）的肌纤维中，Costameres在24 h内部分已被破坏，72 h则完全被破坏，蛋白质印迹分析也证实了Costameres的两种重要蛋白desmin和vinculin几乎完全降解，而此时正是肌肉嫩化的主要时期，因此认为肌肉早期嫩化与costameres的降解高度相关。Costmeres的主要作用是使肌细胞膜与肌纤维联系在一起，Taylor等[11]发现牛肌细胞膜在宰后24 h由0 h时的内陷状态复原，二者相互分离表明Costameres在24 h内已经开始被Calpains降解，所有肌细胞中Costameres连接作用的完全消失是在宰后72 h内，因此表明宰后肌肉Costameres降解的时间主要是宰后24～72 h。Hwan等[12]利用蛋白印迹技术检测牛半腱肌在宰后嫩化过程中肌纤维蛋白降解的试验中也发现desmin宰后的降解，但是其降解时间是发生在宰后72 h与Taylor等[11]的24～72 h有差异，造成不一致的可能原因是试验肌肉不同。即半膜肌中的desmin降解速率快于股二头肌中的desmin降解速率。
3.2 对N2线和肌原纤维间desmin和M-filaments的降解
N2线主要由nebulin和titin组成，二者都穿过Ⅰ区并将N端和C端分别固定于Z线上，N2线的作用是联系肌纤维内粗肌丝和细肌丝。而肌原纤维间desmin和M-filaments也是维持肌细胞结构完整而必需的结构蛋白。
Goll[13]通过对肌纤维显微结构的观察发现N2线在宰后冷储中，首先被降解，由于N2线固定于Z线，因此在于Z线附近也发现有裂缝；作者发现肌细胞中的另一个超微结构的改变是在肌细胞内相邻肌原纤维彼此分离呈游离状态。在正常情况下，相邻肌细胞靠处于Z线的demin和处于M线的M-filaments 连接，因此推测宰后肌肉嫩化过程中相邻肌细胞间desmin和M-filaments被calpain降解。Taylor等[11]通过蛋白印迹技术分析在宰后肌肉储存过程中，发现在宰后24 h内已大约有25%的骨骼肌nebulin降解，而titin在0 h已开始降解，但主要的降解时期是宰后24～72 h，它由T1型降解为较小分子量的T2型，因此宰后肌肉中titin和nebulin的降解与肌肉的早期嫩化显著相关。
4 动物营养对Calpain活性的调控
肌肉生长速率的加快是肌肉蛋白质周转加快的表现，而蛋白质周转是肌纤维蛋白降解和沉积的比值，其中的肌纤维蛋白的降解是受calpain严格调控的。因此，在宰前通过营养调控肌肉沉积速率进而调节了肌细胞中的calpain量，以便为宰后肌肉的嫩度提高提供新的途径。
4.1 饲喂制度
Kristensen等[14]研究由四种不同饲喂制度而造成不同生长速率的猪，在宰后calpain的活性及肌肉的嫩度的变化。在28d-90d-165d试验期间，四种不同饲喂方式分别为全程自由采食（AA），全程限饲（ RR），前期自由采食后期限饲（AR）和前期限饲而后期则自由采食（RA）。通过测定μ-Calpain、m-Calpain及宰后肌肉1、4 d的剪切力发现在生长后期出现了明显的补偿生长的RA处理组的猪μ-Calpain、m-Calpain的活性与AA组的猪无差异，但这两个处理的猪Calpain活性都高于RR和AR处理组。
4.2 营养水平
唐仁勇等[7]报道宰前添加天冬氨酸镁对猪μ-Calpain mRNA含量的影响，发现宰前9 d添加天冬氨酸镁能提高μ-Calpain mRNA的表达量，改善了宰后猪背最长肌24 h的嫩度，而张勇等[15]研究了日粮不同蛋白质水平对猪骨骼肌钙蛋白酶基因表达及嫩度的影响，结果表明日粮不同蛋白质水平对μ-Calpain mRNA在骨骼肌中的表达量有显著影响（P
参考文献：
[1] SAVELL JW， SHACKELFORD S D. Significance of tenderness to the meat industry[J]. Proc Recip Meat Conf， 1992（45）：43-46.
[2] SHACKELFORD S D， WHEELER T L， Meade M K. Consumer impressions of Tender Select beef[J]. Anim Sci，2001（79）：2605-2614.
[3] KOOHMARAIE M， WHIPPLE G， KRETCHMAR D H. Postmortem proteolysis in longissimus muscle from beef， lamb and pork carcasses[J].Anim Sci，1991（69）：617-624.
[4] VEISETH E， SHACKELFORD S D， WHEELER T L. Effect of postmortem storage on mu-calpain and m-calpain in ovine skeletal muscle[J]. Anim Sci，2001，（79）：1502-1508.
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[7] 唐仁勇，陈代文，张克英，等. 宰前短期添加天冬氨酸镁和维生素D3对育肥猪肉品质及μ-Calpain与Calpastatin基因表达的影响[J].中国畜牧杂志， 2008，4428-31.