E―钙粘蛋白、可溶性E―钙粘蛋白在胃部疾病中的检测及其意义

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摘要：目的 研究E-钙粘蛋白（E-cad）、可溶性E-钙粘蛋白（sE-cad）的检测在早期诊断几种胃部疾病，包括慢性萎缩性胃炎、胃溃疡、胃黏膜肠上皮化生、胃癌的临床意义。方法 139例因出现胃肠道症状而接受胃镜检查并配合活检确诊为慢性萎缩性胃炎38例，胃溃疡33例，胃黏膜肠上皮化生28例，胃癌22例，18例无任何病例改变者作为正常对照组。采用免疫组化及双抗夹心酶联免疫吸附法分别检测各标本组织中E-cad的表达情况及胃液中sE-cad水平。结果 慢性萎缩性胃炎组、胃黏膜肠上皮化生组、胃癌组E-cad的表达均较对照组有下降，其差异有统计学意义（P

关键词：E-钙粘蛋白；可溶性E-钙粘蛋白；胃炎；胃黏膜肠上皮化生；胃溃疡；胃癌

E-钙粘蛋白（E-cadherin，E-cad）作为细胞粘附分子成员之一，其表达的上调或下调对炎症的发生，肿瘤的的侵袭、转移有密切关系[1-2]。国内外研究发现，胃癌组织中E-cad的表达较正常胃黏膜组织明显减少或缺失，且呈异质性或非极性变化[3-4]。本文选取确诊为胃癌及癌前病变的几种胃部疾病患者，检测其胃黏膜组织中E-cad的表达及血清中sE-cad的水平。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2010年1月～2015年12月我院门诊、普外科、消化内科因胃部疾病而接受采血及胃镜检查明确诊断的139例患者，其中男性74例，女性65例。

1.2方法

1.2.1标本采集 所有对象于胃镜前1d晨空腹采集，所采集静脉血静置1 h，2500 rpm，离心10 min，获取血清，放置低温冰箱，-80℃保存待测。

1.2.2免疫组织化学检测 一抗为兔抗人E-cad抗体，标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，片厚5 μm，经脱蜡水化后微波抗原修复。免疫组化采用S-P法，E-cad单克隆抗体及S-P试剂盒均为Santa Cruz公司生产，按照说明书操作。操作步骤：①石蜡切片的脱蜡水化：切片置于烤箱中65℃融蜡2 h后，于二甲苯中脱蜡二次（5 min/次），再依次浸入浓度梯度乙醇中（依次为无水乙醇-无水乙醇-95%-85%-75%乙醇），最后置于蒸馏水中各水化5 min。②石蜡切片的抗原修复：石蜡组织切片用柠檬酸缓冲液高压修复。其中修复工作液配制：在1 L去离子水中加入10 ml柠檬酸缓冲液（即IHC抗原修复液，100×），均匀混合即可。具体修复步骤：将修复液置于高压锅中，并将待修复切片浸泡于修复液里（液体必需盖过组织），盖上高压锅盖，加热直至高压锅喷汽，立即开始计时，1～2 min后将高压锅撤离热源，自然降温，取出切片，用蒸馏水（0.01 M，pH值7.4）漂洗2～3次，持续3 min/次。③滴加适量试剂1（即内源性过氧化物酶封]液），室温下孵育10 min后，用PBS充分洗涤。④滴加适量试剂2（封闭用正常羊血清工作液），室温下孵育10 min后，轻轻甩干。⑤滴加适量一抗工作液（按适当比例稀释的浓缩抗体即1∶200兔抗大鼠E-cad抗体）后，置于湿盒中，并于4℃冰箱中孵育过夜，第2d晨用PBS充分淋洗，轻轻甩干。⑥滴加适量试3（生物素标记山羊抗兔二抗工作液），室温孵育30 min后，用PBS充分淋洗。⑦滴入适度的试剂4（HRP 标记的链霉亲和素），室温下孵育10 min后，用PBS洗涤充分。⑧DAB显色剂的制备：按实验所需量，将试剂B与试剂A以19∶1的体积比混匀后即可。也可选择每毫升试剂B中滴加1滴（约50 μl）试剂A，混匀后即可。⑨显色剂显色：加适量的上述显色液滴于需要显色的组织切片上，立即显色，控制时间在1～5 min。通过显微镜下观察控制显色时间，当达到最佳显色效果后，立即自来水冲洗终止显色。显色后的切片经复染、脱水透明，封片后，于电子显微镜下观察结果并拍片。取正常胃粘膜作为阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。正常胃黏膜E-cad在粘膜上皮细胞膜着色呈棕黄色。根据着色细胞数目和着色强弱来判断结果。观察每张病理切片对角线的8个视野，根据文献[5]将染色计为0～3分。0分：细胞膜、细胞质均未染色；1分：细胞质染色为主；2分：异质性染色（细胞膜、胞质混合染色）；3分：连续的细胞膜染色。

1.2.3 ELISA法检测 将-80℃保存的标本置于室温溶解，各待测标本的sE-cad浓度检测操作步骤严格按sE-cad ELISA试剂盒说明书进行。

1.3统计学处理 各样本计数资料采用SPSS17.0软件包统计处理，组间计数资料差异比较采用卡方检验。

2 结果

2.1 E-cad在正常黏膜组织、慢性萎缩性胃炎组织、胃溃疡组织、胃黏膜肠上皮化生组织的表达情况 正常胃黏膜上皮几乎全部上皮细胞膜着色，在细胞相邻的侧面呈连续、同质和极性分布。慢性萎缩性胃炎组织、胃黏膜肠上皮化生组织、胃癌组织中E-cad呈异常表达，细胞膜不着色，或者着色淡、或异质性着色（点状、间断状、小团块胞浆着色），且明显丧失极性（各方向均可见着色）。各实验组与正常组间有显著性差异（P胃黏膜肠上皮化生组>胃癌组。

2.2不同组别血清中sE-cad的含量明显高于正常对照组，并具有统计学意义（P

3 讨论

E-钙粘蛋白（E-cadherin，E-cad）是一个相对分子量为120 kd的钙依赖性细胞粘附分子，定位于细胞间彼此连接的细胞膜处，跨越细胞膜全层，能够介导粘附连接蛋白连接相邻细胞并使细胞-细胞间的连接成熟[6]。血清可溶性E-cad（sE-cad）是位于16号染色体长臂22.1区带基因编码的一种跨膜糖蛋白，分子量约为80～84 KD，是E-cad细胞外蛋白的水解片段。既往国内外众多研究证实，上皮细胞内E-cad的表达下调能导致细胞连接松散，破坏成熟组织结构的完整性和极性[7]。

本研究测得结果，胃黏膜组织中E-cad的表达量为：胃溃疡组>慢性萎缩性胃炎组>胃黏膜肠上皮化生组>胃癌组；而血清中sE-cad的水平结果是：胃癌组>胃黏膜肠上皮化生组>慢性萎缩性胃炎组>胃溃疡组。上述结果表明，E-cad的表达降低与胃癌及其癌前病变的发生有密切的关系。而这一结果也符合从正常胃黏膜发展到胃癌所经过慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生的过程。

综上所述，E-cad作为一种新的肿瘤标志物，其在胃黏膜病变组织中的表达情况结合血清中可溶性E-cad的浓度可作为胃癌及癌前病变判断的重要指标，为胃癌的早期发现提供有力的依据。

参考文献：

[1]Bajpai S，Correia J，Feng Y，et al.{alpha-Catenin mediates initial E-cadherin-dependent cell-cell recognition and subsequent bond strengthening[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，105（47）：18331-18336.

[2]Tsang J Y，Mendoza P，Putti T C，et al.E-cadherin expression in the epithelial components of mammary phyllodes tumors[J].Human Pathology，2012，43（12）：2117.

[3]李|印，马玉泉，李克.胃癌中E-钙粘蛋白的表达意义[J].世界华人消化杂志，2001，9（8）：974-975.

[4]Henke R T，Maitra A，Paik S，et al.Gene expression analysis in sections and tissue microarrays of archival tissues by mRNA in situ hybridization[J].Histology&Histopathology，2005，20（1）：225.

[5]周岱翰.临床中医肿瘤学[M].北京：人民卫生出版社，2003：575.

[6]David J M，Rajasekaran A K.Dishonorable Discharge：The Oncogenic Roles of Cleaved E-cadherin Fragments[J].Cancer Research，2012，72（12）：2917-2923.

[7]Wheelock M J，Johnson K R.Cadherins as modulators of cellular phenotype[J].Annual Review of Cell&Developmental Biology，2003，19（1）：207.