动物中microRNA及其生物发生相关蛋白的研究
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇动物中microRNA及其生物发生相关蛋白的研究范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
摘要：microRNA（简称miRNA）是一类长度为21～25nt内源性的非编码小RNA。研究发现，miRNA广泛参与生命过程中一系列重要的进程，在控制细胞分化、生长发育以及肿瘤发生等过程中都起着重要的作用。miRNA 的产生及功能行使的过程中，需要多种蛋白或者蛋白复合体的参与。本文对动物中miRNA及其生物发生相关蛋白研究进展进行了综述。
Abstract： micrornas （miRNAs） are endogenous noncoding RNAs with about 21～25 nucleotides in length. The study found that miRNAs widely participate in a series of important process of the life and play an important role in the cell differentiation， the process of growth and development of the biology and tumorigenesis. There were many proteins participated in the generation and function of miRNAs. In this study， we researched the miRNAs and its biological related proteins in animals.
关键词：microRNA；生物相关蛋白；功能；展望
Key words： MicroRNA；biological related proteins；function；progress
中图分类号：Q946.1 文献标识码：A 文章编号：1006-4311（2016）03-0183-03
0 引言
真核生物的基因表达调控是一个十分复杂的过程，只有确保基因表达调控准确，才能有益于生物体的生长和发育，否则很可能导致疾病的出现。一系列小分子非编码RNA，包括siRNA（small noncoding RNA），miRNA （microRNA），piRNA（piwi-interacting RNA）和esiRNA （endogenous siRNA）等的发现极大丰富了人们对基因表达调控的理解，它们是对基因调控理论的一个重要补充，揭示了真核生物一种新的基因表达调控方式。miRNA作为小分子非编码RNA家族的一个重要成员，对其进行深入研究，不仅有利于更加全面地认识生命过程，还能够有效地改善人类健康状况，是未来生命科学领域的一个研究热点。
1 miRNA的研究进展
1.1 miRNA的发现
第一个miRNA基因lin-4于1993年在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中被发现[1]，但由于当时实验手段的限制，直至7年之后另一个异时性表达的基因let-7的发现才使大家将目光转移到这类小分子RNA上，从而爆发了在各物种中探寻miRNA的浪潮。2001年《Science》杂志分别报道了三个实验室从线虫、果蝇和人体克隆的几十个类似秀丽隐杆线虫的lin-4的小RNA基因，并将其命名为microRNA。随后各大研究小组分别通过分子克隆和生物信息学预测的方法，陆续在动物、植物、病毒等物种中鉴定出大量的miRNA基因，并将这些鉴定的miRNA基因收录于由剑桥大学的桑格（Sanger）研究中心开发的miRNA数据库miRBase中。miRBase已于2013年6月25日升级至目前最新的版本20.0。相对于版本19.0[2]，在新版本中，miRNA发夹结构前体序列升至24，521条，新增3千余条，成熟体miRNA序列升至30，424条，新增5千余条，其中人成熟体miRNA序列增加至2，578条，小鼠成熟体miRNA序列增加至1，908条。新版本报道的序列涵盖206个物种。
1.2 miRNA的产生
动物内，首先在RNA聚合酶II（Pol II）或聚合酶 III （Pol III）的作用下miRNA进行转录，得到初级转录本pri-miRNA（primary microRNA），其长度通常是1000bp左右。初级转录本pri-miRNA在细胞核中Drosha-DGCR8复合体（Microprocessor complex）作用下进行第一次剪切，加工成具有发夹结构的，长度约为70 nt的前体（miRNA precursor，pre-miRNA），这种发夹状结构的前体通常位于基因组基因间区、内含子或外显子区域。剪切之后，细胞核内生成的miRNA前体在转运蛋白Ran-GTP/ Exportin 5 的作用下由细胞核运输到细胞质，Ran-GTP能选择性绑定pre-miRNA并使其避免被外切核酸酶消化。在细胞质中，pre-miRNA被另一个核糖核酸酶III型酶Dicer识别并加工成长度约为22nt的成熟体miRNA，在加工Dicer蛋白的过程中离不开其PAZ结构域的支持，因为由Drosha蛋白切割产生的在3’端的两个核苷酸长度的悬垂碱基只有其PAZ结构域才能进行识别。而成熟体miRNA变成单链需要利用解旋酶，在RNA诱导的沉默复合物（RISC）中发挥作用。RISC/miRNP复合体中均含有一个Argonaute家族成员蛋白，指导miRNA与靶mRNA的相互作用。
1.3 miRNA的作用机制及功能
miRNA要想实现下调靶基因表达，通常会采取两种方式，一种是通过与靶mRNA之间的互补配对切割信使RNA，另一种是抑制翻译。依据不同的情况选择相适应的方法实现基因表达的目的，具体来说若miRNA与靶基因的匹配程度比较高的话，选择第一种调控基因的方式，反之，若miRNA与靶基因之间的匹配程度比较低的话，则会通过抑制其翻译方式来调控基因的表达[3]。在动物中miRNA通常与靶mRNA的3’非翻译区域以不完全配对方式结合，从而导致翻译抑制。动物中miRNA与靶mRNA匹配过程中，其5’端2～8bp的“种子区”（seed region）在抑制过程中作用不可或缺，其余部分也存在不同程度的影响。现阶段尽管很多物种中都发现了不同种类的miRNA基因，但是于此相关的研究还是寥寥无几。通过突变体表型和传统的基因筛选及定位克隆的方法，研究人员对部分miRNA靶标基因进行鉴定。生物信息学在miRNA的靶基因的预测和功能研究中起着重要的作用。根据预测，miRNA 能调控大约30%的蛋白质编码基因或更多，其中大部分靶标是转录因子或其他具有调控功能的基因，因此miRNA基因被认为是具有调控“调控基因”的功能，能精细调控基因的表达，参与癌症发生、小鼠的胚胎发育、神经元树突棘形态的形成和发育等各种重要性状的调控，甚至还与多种疾病的发生密切相关。
2 参与miRNA产生及功能行使的相关核心蛋白的研究进展
miRNA 的产生及功能行使的过程中，需要多种蛋白或者蛋白复合体的参与。这些蛋白家族涉及Drosha、Dicer、Argonaute 和 Exportin 5 等蛋白家族[1]。
2.1 RNase III型蛋白家族
在miRNA的生物合成过程中，Drosha和Dicer酶介导了前体miRNA及成熟体miRNA的产生。Drosha和Dicer酶均为RNase III家族的成员。RNase III即双链RNA特异性核酸内切酶，根据其结构组成，可以分为三类：第一类蛋白包含一个RNase III结构域 （RIIID）和一个双链RNA结合结构域 （dsRNA-binding domain，dsRBD），主要存在于细菌和酵母中。第二类蛋白包含相继的两个RNase III 结构域（RIIIDa 和 RIIIDb）和一个双链 RNA 结合结构域，该类蛋白及其同源蛋白主要存在于动物中，其分子量在 130～160kDa，N短较长，并且富含脯氨酸、丝氨酸和精氨酸，Drosha属于该类蛋白。第三类蛋白包含 Dicer及其同源物，这类蛋白包含两个 RNaseIII 结构域和一个双链 RNA 结合结构域，另外在长的 N末端还存在一个 RNA 解旋酶（helicase）结构域，DUF283 和 PAZ （Piwi/Argonaute/Zwille）结构域，该类蛋白在酵母、植物和动物中非常保守。虽然 Drosha 和 Dicer 都属于RNase III家族，但Drosha属于第二类 RNase III 型酶，而Dicer 属于第三类 RNase III 型酶。相对于Drosha蛋白，Dicer 蛋白中除了包含两个 RNase III 结构域，还多出一个PAZ结构域，该结构域对其功能至关重要。
2.2 Argonaute蛋白家族
在植物中最先发现的Argonaute蛋白家族，它不仅是目前研究相对较多的蛋白家族之一，也是基因沉默信号转导途径中最先被发现的蛋白家族。Argonaute 蛋白根据序列的同源性以及它们所结合的小RNAs，可以分为三个亚家族：AGO亚家族、Piwi亚家族及一个线虫特异性的WAGO亚家族[4]。其中AGO家族能够与非编码的miRNA和siRNA特异性结合，具有抑制翻译或降解蛋白产物的作用，被广泛的表达于各种动物、植物以及分裂的酵母体中。Piwi亚蛋白家族只存在于动物中，能特异地结合到一类长度为28～30个核苷酸的，与发生有关的小RNA（piRNA）。Piwi亚家族与种系特异性事件相关，如胚胎干细胞的维持和减数分裂等。WAGO亚家族仅仅存在于线虫中，且多存在于线虫Argonaute蛋白家族中。但WAGO亚家族与AGO和Piwi亚家族存在一定的区别，即WAGO蛋白缺乏保守性的DDH金属结合残基，表明其有一个独立剪切的功能。Argonaute 蛋白在物种间高度保守，且不同物种中数量不等，比如酵母中是一个、人和小鼠中都是八个、秀丽线虫中是二十七个等。
Argonaute蛋白是约100kD的碱性蛋白质，其成员都包含PAZ和PIWI两个结构域，另外还包含一个N-末端结构域和MID结构域。相关学者对原核生物的Argonaute蛋白进行研究，结果表明其中的PIWI结构域与RNaseH家族的核糖酶结构具有相似的功能。Argonaute蛋白中位于N端的PAZ结构域含有130个氨基酸，真核生物的PAZ结构域中央是一个β-bar-rel；一侧是两个N 端螺旋；另一侧是一个保守的组件：该组件由一个β-发夹和一个α-螺旋组成。PAZ属于一个结构域，是蛋白质和蛋白质结合形成的，但截至目前其功能还没有一个定论，比较普通的说明是其作用是调节蛋白质之间的同聚化与异聚化。发现具有PAZ结构域的Argonaute蛋白能结合到miRNA的3’末端。果蝇中两个Argonaute蛋白Ago1和Ago2与Dicer能发生免疫沉淀反应，但该反应是否需要依赖PAZ结构域还没有定论。Argonaute蛋白还有一个位于C端的PIWI结构域，该结构域含有300个氨基酸。Argonaute蛋白的结构首次被发现是对黑腹果蝇Argonaute2（DmAgo2）的PAZ结构域进行NMR和X线分析而获得的。PIWI结构域能指导miRNA与靶基因相互作用。一些Argonaute蛋白，它们的PIWI结构域具有剪切活性，活性位点包含一个DDH三联体结构域。需要注意的是一旦Argonaute蛋白中的天冬氨酸和组氨酸残基突变，其活性也就不存在了。
Argonaute蛋白一般位于细胞质中，主要功能通过结合一些小RNA，如siRNAs、miRNAs和piRNAs来发挥各种调节功能。Argonaute蛋白的PIWI结构域通常可以指导miRNA与靶mRNA相互作用，对于具有剪切活性的PIWI结构域能够促进靶 mRNA的降解，而有些 Argonaute 蛋白的PIWI结构域没有剪切活性，这时其作用是促进转录基因的沉默或者抑制 mRNA 的翻译。通常来说大部分的真核生物都含有多个多个Argonaute蛋白家族的成员，并且每个家族成员的作用或者功能不尽相同，比如人类中含有四个Argonaute 蛋白，虽然这些蛋白都可以结合miRNA和siRNA，但是介导对靶RNA的剪切只有Ago2可以做到。在小鼠成体的精母细胞和精原细胞中都存在着piwi同源物Mili，但是piwi同源物Miwi并未在两者中都有表达，只在精母细胞中表达。果蝇中含有5个Argonaute 蛋白家族成员，分别为Piwi、Aubergine、Ago1、Ago2 和Ago3，其中Ago1对于miRNA介导的靶RNA的剪切是必须的[5]，果蝇Ago2 基因组成RNAi过程中RISC的重要组成成份，Ago2突变会导致对dsRNA不产生RNAi的表型，也就是说Ago2对于由外源引入的dsRNA所产生的RNAi是必要的。研究还发现一些人类的Argonaute 蛋白与疾病相关，同时人中另一个piwi同源的基因Hiwi位于染色体不同位置也将影响着人类的健康，直接关系到生殖细胞肿瘤的发生与否。
2.3 Exportin 5蛋白家族
Exportin 5 是一种双链 RNA 结合蛋白，主要存在于细胞核内进行miRNA的运输，它具有介导 miRNA前体从细胞核进入细胞质的功能。Exportin 5除了能运输前体miRNA之外，也能运输其他的小RNA和相关的结合蛋白，如ILF3和JAZ等[6]。Exportin 5与一些tRNAs的运输过程也存在关联，如真核生物的基因组存在两个其它的旁系同源物，Exportin 1和 Exportin-T，其中Exportin 1能够特异地运输小核 RNAs （snRNAs），而Exportin-T能识别成熟的转运 RNAs（tRNAs）。通过对Hela 细胞中 Exportin 5进行 RNA干扰，发现其将导致成熟let-7含量的显著减少，推测其原因可能是有些物种如线虫中有同源物Exportin-T和 Exportin 1的原因，客观上说明了Exportin 5的重要性。Exportin 5蛋白参与的整个核转运过程主要是通过内嵌在核膜中的核孔复合体所介导。首先是可溶性的转运受体识别底物异的序列，接着通过与核孔复合体中核孔蛋白进行相互作用，然后再将底物运输至细胞质。在这个过程中，可溶性的转运受体大部分来自于一个独立的核转运受体家族，该家族在行使功能过程中有一个关键性的辅助因子即GTP酶，主要提供运输过程中的能量，一旦底物被转运出细胞核，则GTP将变为GDP，从而释放出底物。体内实验表明pre-miRNA的3’末端大约两个核苷酸长度的悬垂结构（UU），对于其出核是非常重要的。
miRNA因其独特的调节功能，使其成为当前生物科学领域研究的热点，miRNA的发现丰富了人们对蛋白质合成控制的认识，也是对基因调控理论的一个重要补充，实现了对靶mRNA分子更加全面细致的调节，更具时效性，展现了细胞内基因表达调控全方位多层次的网络系统。同时对中心法则中RNA次要的中介角色来说，miRNA的发现也是重要补充，基于此相关学者将重新思考细胞遗传调控及其发育等方面的重要问题。通过对miRNA及参与miRNA生物合成相关蛋白质的鉴定及特征分析，有利于我们深入理解这些蛋白的功能及其参与小RNA调控的机制，对阐明脊椎动物相关miRNA基因的起源、进化机制也具有深远的意义。
参考文献：
[1]Natalie J. T？ir？ik. Recent advances in the pathogenesis and diagnosis of liver fibrosis[J]. Journal of Gastroenterology. 2008 （5）.
[2]Griffiths-Jones S. miRBase： microRNA sequences and annotation. Curr Protoc Bioinformatics， 2010，Chapter 12：Unit 12 9 1-0.
[3]Valentina Libri，Pascal Miesen，Ronald P. Rij，Amy H. Buck. Regulation of microRNA biogenesis and turnover by animals and their viruses[J]. Cellular and Molecular Life Sciences. 2013（19）.
[4]FlorentCampo\Paysaa， MarieSémon， R. AndrewCameron，Kevin J.Peterson，MichaelSchubert. microRNA complements in deuterostomes： origin and evolution of microRNAs[J]. Evolution & Development. 2011（1）.
[5]Gunter Maubach，Michelle Chin Chia Lim，Henry Yang. miRNA studies in in vitro and in vivo activated hepatic stellate cells[J]. World Journal of Gastroenterology. 2011（22）.
[6]Can-Jie Guo， Qin Pan， Bo Jiang， Guang-Yu Chen， Ding-Guo Li. Effects of upregulated expression of microRNA-16 on biological properties of culture-activated hepatic stellate cells[J]. Apoptosis. 2009（11）.