3种不同破壁方法对椴树蜂花粉中黄酮得率的影响
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【摘 要】以椴树蜂花粉为主要原料，采用超声波、微波、超微粉碎三种不同的破壁的方法，考察对总黄酮溶出量的影响。超声波破壁得到总黄酮含量最高为27.7mg，微波破壁得到总黄酮含量最高为42.8mg，超微粉碎破壁得到总黄酮含量最高为62.3mg，三种破壁方法对总黄酮溶出量的影响为：超微粉碎破壁>微波破壁>超声波破壁。对超声波和微波破壁的研究表明，功率和时间的影响分别为：超声波功率>超声波时间，微波功率>微波时间。采用光学显微镜观察超微粉碎破壁花粉，破壁率达到90%以上。
花粉中不但含有人体通常所需要的营养物质如蛋白质、脂肪、糖、微量元素和各种维生素；还含有黄酮、类胡萝卜素、磷脂、多不饱和脂肪酸等多种生物活性物质；花粉因而被誉为“微型营养库” [1]。蜂花粉能主治心腹胀热邪气，利小便，消瘀血、久服轻身、益气、延年；花粉能够防治脑心血管疾病，降血脂，调节神经系统，促进睡眠，调节胃肠系统功能，促进消化，治疗习惯性便秘；在调节内分泌、提高机体免疫功能、抗衰老、等方面有一定的效果；特别是治疗男性前列腺炎、前列腺肥大有明显的疗效【2】。在很短的时间内就能改善症状；还有明显的防癌抑癌和保肝护肝、防止贫血、糖尿病、抗疲劳等功能。另外，蜂花粉的美容效果明显，其机理在于全面调节人体内分泌系统的平衡，由里及表，从根本上改善皮肤细胞的活力，增强皮肤的代谢机能，防止面部色素沉着、皮肤粗糙、衰老，使皮肤保持湿润、洁白，有光泽，富有弹性。【3】
有效地破开花粉孢子壁，使花粉内含的丰富营养成分得以充分释放，有利于人体吸收和其他利用率，还可改善花粉质感和其它感官指标，解决花粉的脱敏问题。花粉的破壁对黄酮类化合物和营养成分的释放十分有利。破壁后黄酮含量和其它一些营养成分含量明显升高，与其他破壁方法相比，物理破壁具有专一性、反应条件温和、利于保存花粉中的营养活性物质等优点；并且具有高效，破壁效果好，作用稳定的特点，有利于实现花粉破壁的产业化、标准化生产。
1材料与方法
1.1材料与仪器
1.1.1实验材料
椴树蜂花粉，购自养蜂研究所。
芦丁，sigma公司。
乙醇，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠等化学试剂均为分析纯。
1.1.2实验器材与仪器
721分光光度仪（上海元析仪器有限公司）
超微粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）
电子天平（上海精密科学仪器有限公司）
超声波细胞粉碎机（宁波新芝科器研究所）
恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）
微波炉（美的电器公司）
1.2实验方法
1.2.1椴树蜂花粉破壁及黄酮的提取
每份称取花粉1g，采用超声波法、微波法、超微粉碎三种方法对椴树蜂花粉进行破壁。破壁后，按固液比1：30加入体积分数70%的乙醇溶液，在70℃水浴中浸提1h，冷却，过滤，取滤液0.5mL进行黄酮含量的测定。
1.2.2 黄酮含量的测定
总黄酮含量的测定采用硝酸铝分光光度法。
标准曲线的制作：称取干燥至恒重的芦丁标准品10 mg，加少量无水乙醇溶解，蒸馏水定容至10 mL，摇匀配成标准溶液。分别吸取0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mL标准液至10 mL 容量瓶中，加入5 % NaNO3溶液0.4 mL，摇匀，静置6 min；再加入10 % Al（NO3） 3溶液0.4 mL，摇匀，静置6 min；最后加入10 %NaOH溶液4 mL，摇匀，蒸馏水定容至刻度，静置15 min。在510 nm处测定吸光度。作以芦丁浓度Y （mg/mL）与吸光度X的标准曲线。
吸取0.5mL椴树蜂花粉总黄酮提取液，按照上述方法，计算黄酮含量。
2结果与分析
2.1芦丁标准曲线
以芦丁为标准样品，做标准曲线，结果见图1。作以芦丁浓度Y （mg/ mL）与吸光度X的标准曲线，得到线性回归方程如下：y=13.54x（R2=0.9932）。
图1 芦丁标准曲线
Fig.1Glucose standard curve
2. 2超声波功率对椴树蜂花粉总黄酮溶出量的影响
固定超声波时间10min，固液比1：30，浸提温度70℃，浸提时间1h，选择超声波功率200、300、400、500、600W进行椴树蜂花粉黄酮的提取，结果见图2。由图2可见，随着超声波功率的增加，椴树花粉总黄酮的溶出量也逐渐增加，当超声波功率达到600W时，溶出量达到最大，为27.7mg。超声波破壁法是通过冷热的急剧变化使花粉的外膜因破坏而产生裂痕，在裂痕的周围由于超声空化产生的气泡进行强烈振动，其振动力克服了花粉外膜与花粉之间的结合力，起到了扯裂的作用。超声波功率越大，其产生的振动力越强，所以黄酮溶出量越高。
图2超声波功率对椴树蜂花粉总黄酮含量的影响
Fig.2 Effect of ultrasonic power on the content of total flavonoids of pollen
2.3 超声波时间对椴树蜂花粉总黄酮溶出量的影响
固定超声功率不变400w，固液比1：30，浸提温度70℃，浸提时间1h，选择超声波时间5、10、15、20、25、30min进行椴树蜂花粉黄酮的提取，结果见图3。由图3可见，随着超声波时间的增加，椴树花粉黄酮的提取率也逐渐增加，当超声波功时间到7min时，提取率达到最大，为20.5mg。之后随着超声波时间的继续增加，提取率逐渐下降。这主要是由于超声波处理过程中，由于空化反应，会产生一定的热量，使花粉溶液的温度急剧升高，高温会导致花粉的营养素损失，达不到破壁的目的，使总黄酮的溶出量降低。
图3超声波时间对椴树蜂花粉总黄酮含量的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic time on the content of total flavonoids of pollen
2.4 微波功率对椴树蜂花粉总黄酮溶出量的影响
固定微波时间2min，固液比1：30，浸提温度70℃，浸提时间1h，选择微波功率100、80、60、40、20w进行椴树蜂花粉黄酮的提取，结果见图4。由图4可见，随着微波功率的增加，椴树花粉黄酮的提取率也逐渐增加，当微波功率达到40W时，提取率达到38.4mg，之后随着超声波功率的继续增加，提取率逐渐下降，至100w达到峰值，为42.8mg。
图4微波时间对椴树蜂花粉总黄酮含量的影响
Fig.4 Effect of microwave power on the content of total flavonoids of pollen
2.5 微波时间对椴树蜂花粉总黄酮溶出量的影响
固定微波功率60W，固液比1：30，浸提温度70℃，浸提时间1h，选择微波时间30、60、90、120、180s进行椴树蜂花粉黄酮的提取，结果见图5。由图5可见，随着微波时间的增加，椴树花粉总黄酮的溶出量也逐渐增加，当微波时间为90s时，提取率达到最大，为37mg。之后随着微波时间的继续增加，总黄酮溶出量逐渐降低。这可能是由于微波时间过长，导致了杂质溶出，降低了总黄酮的溶出量。
图5微波时间对椴树蜂花粉总黄酮含量的影响
Fig.5 Effect of microwave time on the content of total flavonoids of pollen
2.6超微粉碎粒度对椴树蜂花粉总黄酮溶出量的影响
固液比1：30，浸提温度70℃，浸提时间1h，选择粉碎粒度为20、40、60、80、100目进行椴树蜂花粉黄酮的提取，结果见图6。由图6可见，随着粒度的增加，椴树花粉黄酮的溶出量也逐渐增加，当粒度达到60目时，溶出量达到最大，为62.3mg。之后随着粒度的继续增加，提取率逐渐下降。
花粉细胞在超微粉碎过程中，细胞受到强烈的正向挤压力和切向剪切力的共同作用下，细胞被挤压、剪切，细胞壁被撕裂、断开，因此，细胞被撕裂成碎片或被压破，各种成分得以充分混匀。花粉破壁后，有效成分直接进入溶媒，使黄酮溶出量增加。
图6 超微粉碎粒度对椴树蜂花粉总黄酮含量的影响
Fig.6 Effect of ultrafine grinding granularity on the content of total flavonoids of pollen
3.结论
本试验是以椴树蜂花粉为主要原料，采用超声波、微波、超微粉碎三种不同的破壁的方法，考察对总黄酮溶出量的影响。超声波破壁得到总黄酮含量最高为27.7mg，微波破壁得到总黄酮含量最高为42.8mg，超微粉碎破壁得到总黄酮含量最高为62.3mg，三种破壁方法对总黄酮溶出量的影响为：超微粉碎破壁>微波破壁>超声波破壁。对超声波和微波破壁的研究表明，功率和时间的影响分别为：超声波功率>超声波时间，微波功率>微波时间。
参考文献：
[1]曹炜，尉亚辉.蜂产品保健鲰理与加工技术[M].北京：化学工业出版杜.124―151.
[2]王开发.我国花粉研究新进展与产品市场分析[J].蜜蜂杂志，2007，2：11―13.
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