骨组织工程中种子细胞的研究进展
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文章编号：1004-7484（2013）-02-1011-02
因肿瘤、感染、外伤、先天疾病等原因导致的骨缺损是临床常见疾病。如何修复骨缺损使功能与美观更好地结合，是人们不断研究改进的目标。以往临床上常用的方法包括：人工骨移植、自体骨移植、同种异体骨移植、牵张成骨等，然而，人工骨移植存在着生物相容性的问题；自体骨移植存在着来源有限，且需牺牲健康组织的缺点；同种异体骨移植存在着供体来源不足，免疫排斥等问题；牵张成骨又存在着疗程长，可能损伤神经、关节，在恢复咬合关系方面难以控制等不足。
组织工程学的迅速发展，为骨组织缺损的重建和修复开辟了新的路径，为再生医学领域带来了新的生机。经过二十余年的不断研究，骨组织工程取得了一定的进展。种子细胞、生物支架材料和生长因子是组织工程的三大要素。本文将就种子细胞及其在骨组织工程中的研究进展作一综述。
1 种子细胞
种子细胞是指利用组织工程技术再造组织或器官所用各类细胞的总称。就骨组织工程来讲，种子细胞需满足以下要求：①便于取材，尽可能降低对机体的损伤；②细胞增殖能力强；③易分化为成骨细胞；④低免疫源性，无排斥反应；⑤回植体内，对机体无毒性作用和致瘤性。
1.1 成体干细胞 成体干细胞是指存在于分化组织中的未分化的细胞，具有自我复制功能，主要来源于骨髓、血液、骨骼肌、角膜、牙髓、肝脏、皮肤、消化道上皮等[1]。目前以骨髓间充质细胞（BMSCs）研究最多。
1.1.1 骨髓间充质细胞 骨髓间充质细胞（BMSCs）具有很强的增殖能力和多向分化潜能。在一定的诱导条件下，可以分化为成骨细胞[2-3]、软骨细胞[4]、脂肪细胞[5]、肌细胞[6]、神经细胞[7]等。目前，地塞米松、维生素C及β-甘油磷酸钠联合应用促进BMSCs向成骨细胞分化是最为常用的方法。地塞米松可使BMSCs的碱性磷酸酶（ALP）活性增强，刺激细胞外胶原基质的生物合成，促进干细胞向成骨细胞分化[8]。研究认为培养基中地塞米松浓度一般以10-8-10-10mol/L为宜，浓度过高可导致干细胞向脂肪细胞分化。维生素的作用在于可调节ALP的活性，且能够促进体外培养细胞（成骨细胞）合成胶原，形成钙化。在培养液中，β-甘油磷酸钠可迅速被碱性磷酸酶水解，产生大量钙盐形成及沉积所需的磷酸离子，促进结节钙化[9]。另外，成骨诱导分化过程中需要多种细胞外信号——生长因子共同参与调节。目前已应用于骨组织工程的主要有：骨形成蛋白（BMP），（包括BMP-2、BMP-7等），类胰岛素生长因子I和II（IGF I and II），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），转化生长因子β（TGF-β），血小板衍生生长因子（PDGF）及血管内皮细胞生长因子（VEGF）等。骨形态发生蛋白（BMP），其成骨作用已被大量研究证实，是目前已知的唯一能使间充质干细胞（MSC）向骨或软骨细胞分化的最有效的促骨生成因子[10]。以BMSCs作为种子细胞的骨组织功能技术已在颅骨和牙槽骨缺损的治疗中取得了较满意的效果[11-12]。袁捷等[13]通过自体BMSCs复合珊瑚羟基磷灰石构建组织工程化骨，成功地修复了犬下颌骨缺损。虽然BMSCs在骨组织工程中取得了很大进展，但其自身仍存在很多缺点，研究表明：骨髓中每1x105个单核细胞中只有2-5个BMSCs[14]；随着年龄老化，干细胞数量显著降低，增殖分化能力明显减弱；取材对供体有创伤，患有骨髓疾病者，不能采集。
1.1.2 脂肪干细胞 脂肪干细胞（ADSCs）作为种子细胞，近年来正逐渐成为研究热点。其有着诸多优点：脂肪组织中ADSCs含量丰富，平均2x108/L；有多分化潜能；体外培养倍增速度快；不易老化等。自发现ADSCs以来，Zuk等[15]对其进行了深入的研究，证实其在适当的诱导条件下可以向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌细胞等分化，表明具有多分化能力。有学者将大鼠ADSCs复合到PLGA支架材料上，植入裸鼠背部肌袋内，成骨形成骨组织，证明ADSCs具有异位成骨能力。2009年，国外有病例报道（1例）：通过自体脂肪干细胞肌皮瓣内异位成骨修复上颌骨大面积缺损，取得了较满意的效果[16]。Cui L等[17]在体外成骨诱导ADSCs，以珊瑚为支架材料，成功修复了犬颅骨缺损。虽然ADSCs有着良好的应用前景，但也存在着诸多问题：如何分离纯化，确立鉴定标准，体内试验的研究情况还鲜有报道。这些都还有待于进一步研究。
1.1.3 其他组织来源成体干细胞 近年来，有学者在外周血液、骨骼肌、皮肤、肝脏等组织中也发现了具有多向分化潜能的成体干细胞。Johnny Huard等成功分离出肌肉干细胞（MDSC），对其鉴定发现其具有分化为骨细胞、脂肪细胞和肌细胞的能力[18-19]。Yoshii等[20]最近的研究表明：从骨小梁或松质骨分离出来的骨小梁内皮祖细胞有成骨细胞的潜力，可用于构建组织工程化骨。从人的牙髓和牙周膜分离出的多能干细胞也具有分化为成骨细胞的潜能，还可以分化为牙本质、牙骨质、脂肪细胞和神经细胞等[21-23]。
1.2 胚胎干细胞 胚胎干细胞（ES）是源于早期胚胎、原始生殖细胞的一类干细胞，由囊胚的内细胞团经分离后培养获取，具有稳定的体外自我更新能力。理论上可诱导分化为三个胚层的所有细胞，具有发育全能性。目前，以小鼠的ES细胞系的体外培养技术最为成熟。1998年，James Thomson等成功地建立了人类ES细胞系[23]，为研究人类胚胎的早期发育奠定了基础。Buttery LD等诱导ES细胞向成骨细胞分化，获得了接近纯化的成骨系胚胎干细胞。由于ES的无限增殖性和多分化能力，其有望成为组织工程中理想的种子细胞。但ES的研究目前尚处于初步阶段，限于医学伦理、定向分化的控制、体内移植是否致瘤等问题，还需进一步研究探索。
1.3 成骨细胞 成骨细胞来源于骨膜生发层，具有一定的增殖能力。其主要功能是合成和分泌骨基质，以及促进骨基质矿化成骨。四川大学华西医院于2000年开始应用同种异体成骨细胞作为种子细胞复合生物衍生骨支架材料构建组织工程骨，对52例患者不同部位骨缺损、骨不愈合进行修复，取得了良好的治疗效果。术后平均随访一年半左右，未发现明显组织排斥反应和其他并发症。初步证实同种异体成骨细胞构建组织工程骨具有较强的增殖和成骨能力。Pradel等用自体成骨细胞作为种子细胞，构建组织工程骨修复牙槽突裂，影像结果显示：术后18个月，牙槽突裂裂隙区有新骨形成，组织工程骨参与了修复工作。现今成骨细胞亦存在一些问题：目前培养液还没有统一的标准；难以大量获取且取材会对供体造成损伤；增殖能力不够强，使其临床大规模应用受到限制。
1.4 羊膜间充质细胞 羊膜间充质细胞（hAMCs）是近年来研究证实的一种具有与BMSCs相似特性的干细胞。来源于胎盘羊膜组织。胎盘是产后的废弃物。羊膜是胎盘最贴近胎儿侧的一层半透明薄膜组织，表面没有血管、神经及淋巴组织。在体外特定诱导条件下，hAMCs能够分化成三个胚层的所有细胞，包括神经细胞、心肌样细胞、胰腺细胞、成骨和软骨细胞等其作为种子细胞有以下特点：①hAMCs具有较强的增殖活性，Anker等研究表明其体外扩增能力明显强于BMSCs；②有充足的细胞来源，且人羊膜取材方便，在孕妇正常分娩过程中被排出体外，不需要进行额外的手术操作，也不涉及伦理道德问题；③具有低免疫源性。大量研究表明：hAMCs弱表达HLA-ABC，不表达HLA-DR抗原。从羊膜中获取到的细胞不会引起同种异体和异种淋巴细胞增殖，并且能够有效抑制外周血单核细胞（PBMCs）增殖及淋巴细胞反应，不引起免疫排斥反应。在临床应用方面，羊膜已经用于眼科移植手术多年，郭萍等用羊膜移植治疗春季卡他性结膜炎取得了较好的临床疗效，未出现免疫排斥反应。宋秀军等研究并证实hAMCs具有分化为成骨细胞的特性，可作为骨组织工程种子细胞，但其作为骨组织工程种子细胞的骨修复能力还有待进一步研究。朴正福等通过体外癌化实验，表明hAMCs不引起癌化，无致瘤性，是细胞移植中较为理想的种子来源。但其移植体内是否致瘤还有待进一步探讨。
2 展望
骨组织工程的发展为骨缺损的修复开启了一扇新的大门。在未来相当一段时间内，种子细胞仍是组织工程的研究重点。BMSCs凭借相对良好的生物特性，已成为骨组织工程的主要种子细胞来源，在临床初步应用上取得了较满意的效果。hAMCs作为介于胚胎干细胞与成体干细胞间的一类中间等级的干细胞，具有低免疫原性、高增殖能力、强分化潜能、来源方便等独特的优越性，在组织工程中将具有广阔的应用前景。组织工程化骨要真正走向临床应用还需要大量的动物及临床实验，通过反复验证，解决或改进各种问题。相信随着科技的发展，我们终将获取性状更为优良，更适合临床应用的骨组织工程种子细胞。对整个组织工程而言，这也将是具有重大历史意义的时刻。
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