响应面法对超声波提取藤茶二氢杨梅素工艺的优化
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇响应面法对超声波提取藤茶二氢杨梅素工艺的优化范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
摘要：通过响应面分析法对超声波提取梵净山野生藤茶（Ampelopsis grossedentata）二氢杨酶素的工艺条件进行优化。以乙醇体积分数、料液比、提取时间为影响因素，在单因素试验的基础上，采用3因素3水平响应面分析法，根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，以二氢杨酶素提取率为响应值，进行响应面分析，优化超声提取梵净山野生藤茶中二氢杨梅素的条件。结果表明，超声波提取藤茶中二氢杨梅素最佳工艺条件为乙醇体积分数51.00%、料液比1∶26.00（g∶mL）、超声波时间40.00 min，在此条件下二氢杨梅素的提取率为28.41%，回归模型预测的二氢杨梅素提取率为28.61%，经验证RSD为1.16%，拟合度较好，说明响应面法优化超声提取藤茶二氢杨梅素的工艺条件稳定可行。
关键词：藤茶（Ampelopsis grossedentata）;二氢杨梅素;超声波提取;响应面分析法
中图分类号：S567.5+3;R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）02-0416-05
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2015.02.040
Optimizing Ultrasonic-assisted Extraction of Dihydromyricetin from the Wild Ampelopsis grossedentata in Fanjing Mountain with Response Surface Method
LIANG Li，QIU Lan，ZHANG Liang
（Department of Biological and Chemical Engineering， Tongren University/Research Center for Conservation and Utilization of Wildlife Resources in Fanjing Mountain/Key Laboratory of Special Wildlife Resources in Fanjing Mountain， Tongren 554300， Guizhou，China）
Abstract： Response Surface Method was used to optimize the extraction of dihydromyricetin from the wild Ampelopsis grossedentata with ultrasonic wave. The concentration of alcohol， the ratio of solid to liquid and ultrasonic time were selected on the basis of single factor experiment with 3 factors and 3 levels of Box-Behnken center combination experimental design. The extraction rate was used as response value for response surface analysis. The conditions of dihydromyricetin ultrasonic-assisted extraction were optimized. The results showed that the optimal conditions were alcohol concentration 51.00%， ratio of solid to liquid 1∶26 g/mL， extraction time 40.00 min. Under these conditions， the extraction rate of dihydromyricetin was 28.41%. The predicted extraction rate of dihydromyricetin was 28.61%. Through verification test， the relative standard deviation was 1.16% and fit well. It is indicated that the optimized process was stable and feasible.
Key words： Ampelopsis grossedentata; dihydromyricetin; ultrasonic extraction; response surface analysis method
藤茶属葡萄科（Vitaceae）蛇葡萄属（Ampelopsis），学名为显齿蛇葡萄 （Ampelopsis grossedentata）， 俗称甜树茶、甜茶藤等，是一种多年生的藤本植物，生长在海拔400～1 300 m的山坡、林中、河滩等阴湿和肥沃的土壤中，是一种典型的药食两用植物[1]。藤茶中含有多种化学成分，包括水分、蛋白质、维生素、多酚和黄酮等，其中黄酮类化合物具有最重要的药理作用，而二氢杨梅素是其中最重要的黄酮类化合物，藤茶系目前国内外发现的二氢黄酮类化合物中含量最高的植物[2]，经试验证明，二氢杨梅素具有抗氧化、镇痛、止咳、广普抑菌、保肝护肝、降血糖、降血脂、增强人体免疫力以及抑制肿瘤等多种功效[3]，具有很高的应用价值。
梵净山位于贵州省东北部江口、印江和松桃3县交界之处，总面积567 km2，主峰凤凰山海拔2 572 m，是武陵山系最高的山体，是一个以珍稀植物和动物为主的国家级自然保护区。1986年被联合国教科文组织批准接纳为世界“人与生物圈”保护区网的成员[4]。该保护区植被类型多样，主要有针叶林、阔叶林、竹林、灌丛、沼泽5个类型[5]，植物资源极为丰富，达1 800种[4]，是非常宝贵的药用植物资源库。目前关于梵净山野生藤茶二氢杨梅素的提取尚未见报道。
本研究以梵净山野生藤茶为原料，在超声波辅助提取藤茶中二氢杨梅素的基础上，采用Box-Behnken响应面法对提取条件进行优化，为开发梵净山野生藤茶及其综合利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
试验所用藤茶采自梵净山，将藤茶在60 ℃下烘干，经高速万能粉碎机粉碎，过40目筛，将其装于干燥试剂瓶，贴上标签作为待测样品。
主要试剂：二氢杨梅素标准品（纯度>98%，上海融禾医药科技有限公司）;95%乙醇[分析纯，重庆川东化工（集团）有限公司];无水三氯化铝（天津市博迪化工有限公司）等。
主要仪器：GUTEL超声波清洗器（上海冠特超声仪器有限公司）;101-3型电热鼓风干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）;FW80型高速万能粉碎机（北京科伟永兴仪器有限公司）;KQ-C型玻璃仪器气流烘干器（巩义市予华有限责任公司）;电子分析天平（奥豪斯仪器上海有限公司）;SHZ-DIII予华牌循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）;T6型新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）等。
1.2 试验方法
1.2.1 标准曲线的绘制 准确称取二氢杨梅素标准品5.2 mg，用95%的乙醇定容到50 mL容量瓶中e均，分别吸取溶液0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL置10 mL容量瓶中，精确加入质量分数为5%的AlCl3溶液3 mL，用95%的乙醇溶液定容到10 mL，e均后放置40 min，在315 nm的波长下测定吸光度[6]，以标准溶液的含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线（图1），得到的回归方程为：A=78.686x+0.006 7，R2=0.998 9（n=5）。
1.2.2 藤茶中二氢杨梅素含量的测定 准确称取1 g藤茶粉末放入锥形瓶中，按1∶20（g∶mL，下同）的料液比加入50%的乙醇浸泡10 min，放入超声波功率80 W处理40 min吸取提取液抽滤。将趁热抽滤的提取液装于大试管中，抽取0.1 mL于10 mL的容量瓶中，用95%的乙醇定容至刻度摇匀，抽取1 mL于另外的10 mL容量瓶中，加入5%的AlCl3 3 mL，用95%的乙醇定容至刻度e匀，同时做空白液对照，在室温下放置40 min，于分光光度计中测定吸光度[7]，其提取率的计算公式为：
二氢杨梅素的提取率=（A-0.006 7）×V×P×K/1 000×G×78.686×100%
式中，A为提取液的吸光度;V为提取液的体积（mL）;P为稀释倍数（P=1 000倍）;G为藤茶的质量（g）;K为二氢杨梅素在总黄酮中的质量分数（K=0.86）[8]。
1.2.3 单因素试验 设置单因素试验分别考察超声波提取二氢杨梅素时乙醇体积分数、料液比、提取时间对二氢杨梅素提取率的影响。①乙醇体积分数。室温（20 ℃）下放置10 min、料液比1∶20、超声时间40 min、超声波功率80 W，乙醇体积分数分别取30%、40%、50%、60%、70%、80%。②料液比。室温（20 ℃）下放置10 min、超声波时间40 min、超声波功率80 W，料液比分别取1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35。③提取时间。室温（20 ℃）下放置10 min、乙醇体积分数50%、超声波功率80 W，提取时间分别为20、30、40、50、60、70 min。
1.2.4 响应面优化试验设计 根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，结合单因素试验结果，利用Design-Expert.V8.0软件设计响应面试验，选取乙醇体积分数（A）、超声波时间（B）、料液比（C）为自变量，二氢杨梅素提取率（Y）为响应值[9-12]，做3因素3水平共17个试验点的二次回归正交组合设计试验。利用Microsoft Office Excel 2007、Originpro7.5、Design-Expert.V8.0软件来进行数据处理和分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 乙醇体积分数对二氢杨梅素提取率的影响 由图2可知，随着乙醇体积分数的增加，提取率逐渐增加。当乙醇体积分数为50%的时候提取率达到最大，继续增加乙醇体积分数，二氢杨梅素的提取率又呈下降趋势，出现这种情况的原因是因为二氢杨梅素为极性化合物，根据相似相容的原理，当溶剂体系的极性与二氢杨梅素的极性相当时，二氢杨梅素的提取率达到最佳。从图2中可以看出，乙醇体积分数为50%时，溶剂体系的极性与二氢杨梅素的极性相当，所以这时候的提取率达到最大，因此，乙醇体积分数为50%时最佳。
2.1.2 提取时间对二氢杨梅素提取率的影响 由图3可以看出，由于二氢杨梅素热稳定性相对较好，在较短的时间内，其结构不会发生太大的变化，在其他条件恒定时，二氢杨梅素的一般提取率的超声波提取时间为20～50 min，随着时间的延长提取率呈现先增后降的趋势，当超声波提取时间为40 min时，二氢杨梅素的提取率达到最大，因此40 min为最佳的提取时间。
2.1.3 料液比对二氢杨梅素提取率的影响 一般情况下，随着溶剂的增加，可以使细胞壁内外浓度差增大，有利于有效成分的溶出，提取效果就越好。从图4可以看出，料液比在1∶10～1∶25之间时，随着溶剂的增加，二氢杨梅素提取率逐渐增大，在1∶25时达到最大，之后随着溶剂的增加，二氢杨梅素的提取率反而缓慢的下降，因此确定料液比为1∶25最为合适。
2.2 响应面试验结果
根据单因素试验结果确定响应面各因素及水平如表1所示。采用Design-Expert软件，选用Box-Behnken模型，以野生藤茶中二氢杨梅素提取率为响应值，设计3因素3水平共17个试验点的响应面试验，试验结果如表2所示。通过Design-expert.V8.0软件对响应面试验结果进行回归分析，以A、B、C为自变量对提取率Y进行数据拟合建立如下多元二次回归数学模型：Y=28.17+1.72A+1.08B+1.79C-0.095AB+0.24AC-1.36BC-6.14A2-3.44B2-2.87C2
为了检验方程的有效性，对藤茶中二氢杨梅素提取的数学模型进行了方差分析，结果见表3。由表3可知，此模型F值为28.93，P=0.000 1，该模型极显著，失拟项不显著（P=0.084 9>0.05），说明建立的模型与实际有较好的拟合度。该方程的回归决定系数为0.973 8，说明有97.38%的响应值符合此模型，校正决定系数为0.940 2，说明有94.02%的试验数据可用此回归模型来解释，其中变异系数为5.08%、精密度为14.365%，说明此方程具有良好的稳定性和精密度[13]。综上所述，该模型能较好地拟合实际超声波提取藤茶中的二氢杨梅素。
为了更直观地表现两个因素同时对藤茶中二氢杨梅素提取率的影响，通过Design-Expert.V8.0对试验因素A、B、C以任意一项为固定值对其余两项进行响应面分析和作图[14]，以考察各交互项对藤茶中二氢杨梅素提取率的的影响，结果见图5、图6和图7。
由图5（a）可知，当料液比确定为最佳值1∶25时、乙醇体积分数不变，可知提取时间响应面曲线图比较平缓，在料液比为1∶25、提取时间不变时，随乙醇体积分数的增加，提取率先增大后减小，说明在此条件下乙醇体积分数对响应值的影响比较大。从图5（b）可知，提取时间和乙醇体积分数的等高线呈圆形，说明提取时间和乙醇体积分数对超声波提取藤茶中二氢杨梅的交互作用不显著。
由图6（a）可知，当乙醇体积分数确定为最佳值50%时，提取时间不变，随着料液比的增加，提取率先增大后缓慢降低，当料液比不变时，随提取时间的延长，提取率也缓慢降低，说明在此条件下提取时间和料液比响应面曲线呈先增大后减小的趋势，说明两者增加对二氢杨梅素的提取率影响效果明显。从图6（b）可知，提取时间和料液比的等高线图呈椭圆形，说明提取时间和料液比对超声波提取藤茶中二氢杨梅素的交互作用显著。
由图7（a）可知，当提取时间确定为最佳值40 min时，乙醇体积分数不变时，料液比响应面比较平缓，说明在此条件下料液比对二氢杨梅素提取率影响效果不明显，当料液比不变时，随乙醇体积分数增大提取率先增大后减小，说明此条件下乙醇体积分数对二氢杨梅素提取率影响效果明显，从图7（b）可知，乙醇体积分数和料液比的等高线呈圆形，说明乙醇体积分数和料液比对超声波提取藤茶中二氢杨梅素的交互作用不显著。
综合分析响应面试验结果可知，考虑各因素交互作用可知AB、AC交互作用不明显即乙醇体积分数与提取时间、乙醇体积分数与料液比交互作用不明显，BC交互作用明显即提取时间与料液比交互作用明显。
通过Design-Expert.V8.0对二元回归方程求最大值[15，16]，得最佳提取工艺条件为乙醇体积分数51.45%、料液比1∶26.48、提取时间为40.96 min，提取率为28.61%。根据实际情况选取乙醇体积分数为51.00%、料液比为1∶26.00、提取时间为40.00 min，在此条件下重复试验5次测得二氢杨梅素的实际提取率为28.41%，接近理论提取率，RSD为1.16%，说明响应面法建立的藤茶二氢杨梅素提取数学模型具有稳定可靠性，试验结果与模型符合良好。
3 小结
以梵净山野生藤茶为原料，通过单因素试验，分析了乙醇体积分数、超声波提取时间、料液比对野生藤茶中二氢杨梅素提取率的影响。用Design-Expert.V8.0软件中的Box-Benhnken（BBD）中心组合原理设计响应面试验，建立了以乙醇体积分数、提取时间、料液比为自变量，以野生藤茶二氢杨梅素提取率为响应值的多元二次回归数学模型，得出超声波辅助提取梵净山野生藤茶中二氢杨梅素的最佳提取工艺为：乙醇体积分数51.00%、超声波时间40.00 min、料液比1∶26.00，在此条件下实际提取率为28.41%，与Design-Expert.V8.0分析预测值相差较小，RSD为1.16%，因此认为经优化后的提取条件合理可行。梵净山野生藤茶中二氢杨梅素具有一定的抗氧化、免疫、降血脂、降血糖等保健作用。因此，野生藤茶中二氢杨梅素在食品和医药工业中，具有广泛的开发价值。
参考文献：
[1] 钟 梅，陈玉琼.正交优选藤茶饮料的微波提取工艺[J].湖北农业科学，2009，48（2）：432-434.
[2] 刘建新，周天达.瑶族藤茶对兔肠平滑肌的影响和解酒实验研究[J].中国民族医药杂志，1998，4（2）：43-44.
[3] 曹敏惠，徐胜臻，倪德江，等.藤茶中二氢杨梅素的提取和应用研究进展[J].化学与生物工程，2008，25（12）：17-19.
[4] 周政贤.梵净山研究[M].贵阳：贵州人民出版社，1990.
[5] 吴征镒.中国植被[M].北京：科学出版社，1983.
[6] 姚茂君，黄继红.二氢杨梅素的超声波辅助溶剂提取工艺[J].食品与生物技术学报，2007，26（3）：20-23.
[7] 郑 成，高晓明，杨 铃，等.藤茶中二氢杨梅素的微波萃取[J].广州化工，2005，33（2）：12-14.
[8] 高建华，罗尧晶，宁正祥.植物黄酮二氢杨梅素的提纯及结晶形态研究[J].天然产物研究与开发，2006（1）：81-84.
[9] 闫克玉，高远翔.响应面分析法优化槐米总黄酮提取工艺[J].食品研究与开发，2009，30（7）：21-24.
[10] 徐红艳，包怡红，杨丽芸，等.响应面法优化超声波辅助提取胡桃楸种仁壳总黄酮工艺[J].食品工艺科技，2012（17）：248-251.
[11] 熊建华，吴 琴，林丽萍，等.响应面分析法优化超声提取樟树籽油的工艺[J].中国粮油学报，2013，28（3）：65-69.
[12] 罗 丽，梁 琪，张 炎，等.响应面法优化超声波辅助提取沙枣果总黄酮工艺[J].食品工艺科技，2013，34（5）：269-274.
[13] 林忠宁，何友建，陆 A，等.响应面分析法优选灵芝超声波提取工艺的研究[J].中国食品学报，2012，12（7）：97-103.
[14] 买吾兰江，买提努尔，艾来提，等.响应面超声波提取黄花柳总黄酮工艺[J].新疆农业科学，2009，46（4）：867-872.
[15] 翟旭峰，胡明华，冯梦莹，等.超声提取灵芝多糖的工艺研究[J].现代食品科技，2012，28（12）：1704-1708.
[16] 陈 健，孙爱东，高雪娟，等.响应面分析法优化超声波提取槟榔原花青素工艺[J].食品科学，2011，32（4）：82-86.