心肌梗死大鼠毛细血管周细胞变化及益气活血中药对其的影响
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摘要：目的 观察心肌梗死大鼠毛细血管周细胞变化及益气活血中药的作用，探讨益气活血中药改善心肌血流灌注的作用机制。方法 采用SD大鼠冠状动脉结扎法制备急性心肌梗死（AMI）模型，在心电图评价的基础上将造模成功的动物随机分为模型组、益气活血组（给予益气活血药治疗）、培哚普利组（给予培哚普利治疗）和通心络组（给予通心络治疗），以假手术组为对照，共5组，模型组和假手术组给予生理盐水进行干预。选择治疗后第7、28日2个时间点，观察各组大鼠心肌毛细血管密度（MCD）和毛细血管周细胞数量的变化。结果 模型组大鼠心肌梗死边缘区MCD较假手术组明显下降、周细胞计数明显增加（P
关键词：益气活血药；毛细血管密度；周细胞计数；心肌梗死；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.07.015
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）07-0038-05
Change of Capillary Pericapillary Cells in Rats with Myocardial Infarction and Effect of Supplementing Qi and Activating Blood Circulation Herbs HUANG Kun， YANG Dan-dan， GUO Shu-wen， SUN Qing， ZHANG Lu， QI Xin， WAN Ting， ZHENG Cheng-long （Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029 ， China）
Abstract：Objective To observe the change of capillary pericapillary cells in rats with myocardial infarction and the influence of supplementing qi and activating blood circulation herbs， and explore its mechanism of improving myocardial perfusion. Methods The rat model was established by ligaturing the left anterior descending coronary artery. On the base of ECG evaluation， successfully modeled rats were randomly divided into the model group， group treated with supplementing qi and activating blood circulation Chinese medicine （activating blood and supplementing qi group）， group treated with Perindopril （Perindopril group）， group treated with Tongxinluo Capsules （Tongxinluo group）. The sham-operation group was taken as the control. There were totally 5 groups. The model group and the sham-operation group were treated with normal saline. The changes of myocardial capillary density （MCD） and number of pericapillary cells on the 7th， 28th day after medicinal administration were observed. Results On the 7th and 28th day， the MCD decreased significantly and the number of capillary pericapillary cells increased significantly in the model group compared with the sham-operation group （P
Key words：supplementing qi and activating blood circulation herbs；myocardial capillary density；number of pericapillary cells；myocardial infarction；rats
研究显示，心肌梗死患者虽然经过搭桥或支架置入术后使梗死相关冠脉再通，或经冠脉造影证实已达TMI3级血流的梗
基金项目：国家自然科学基金（81173142）
通讯作者：郭书文，E-mail：
死相关血管，有超过25%的患者心肌组织水平的血流灌注并未恢复[1]。因此，减少缺血心肌再灌注损伤、保持心肌微血管的完整性、改善缺血心肌血供状态、恢复心肌细胞功能，是目前研究的热点问题。
前期的系列研究结果显示，益气活血方能明显促进大鼠缺血心肌微血管生成而改善心肌缺血，并能抑制心肌细胞凋亡，对相关蛋白及细胞因子有显著调节作用[2-4]。本研究采用结扎冠状动脉的方法建立大鼠急性心肌梗死后心衰模型，利用免疫组织化学方法观察模型大鼠心肌毛细血管周细胞的变化，以及益气活血中药对其的影响，进一步探讨益气活血中药改善心肌血流灌注的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
健康雄性SD大鼠，体质量（200±20）g，清洁级，8周龄，中国科学院动物研究所提供，许可证号：SCXK（京）2012-0001。
1.2 药物
益气活血药由黄芪、人参、当归、川芎、三七粉等组成。根据前期研究结果[5-6]选择益气活血药（2∶1）的剂量组合[5-6]。依口服剂工艺制备，按处方比例称取中药材，加9倍量水，煎煮2次，每次2.5 h，共5 h，水煎液过滤，浓缩，加乙醇调含醇量至50%，过滤，回收乙醇，过滤，调整浓度为相当原药材2 g/mL，北京中医药大学药厂提供。
对照药物选用通心络胶囊，石家庄以岭药业股份有限公司生产，批号110723-120116；培哚普利片，施维雅（天津）制药有限公司，批号P2009971052951。
1.3 试剂与仪器
BA3414 兔抗鼠CD34抗体（武汉博士德生物工程有限公司产品），BM0002小鼠抗α-SMA抗体（武汉博士德生物工程有限公司产品），血清内皮素-1（ET-1）、一氧化氮（NO），南京建成生物工程公司提供。RSP1002型小动物呼吸机（Kent Scientific Corporation）。
2 实验方法
2.1 造模
采用左冠状动脉前降支结扎方法[7]。用1%戊巴比妥钠腹腔注射（40 mg/kg）麻醉后，背位固定，行气管插管，连接小动物呼吸机，在左侧第3、4肋间切开皮肤，钝性分离肌层，打开胸腔，用开胸器推开胸腺扩大手术视野，充分暴露心脏，用带线缝合针在左心耳与肺动脉圆锥之间于左心耳下约2 mm处，无张力的状态下将左前降支连同少量的心肌组织一起结扎，然后迅速将心脏复位，关闭胸腔。全部手术过程在30 min内完成，严格无菌操作。术后连续3 d肌肉注射青霉素预防感染。以结扎部位以下心肌变灰白、搏动减弱、心电图肢体导联出现ST段弓背向上明显抬高为造模成功的标志。假手术组手术过程相同，仅绕过左冠状动脉，打松结。
2.2 分组与给药
将大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、中药组、培哚普利组、通心络组。
各组于造模的第1日开始分别灌胃相应药物，每日1次。通心络组每日给予通心络胶囊30 mg/kg体质量，培哚普利组每日给予培哚普利片0.72 mg/kg体质量，益气活血组每日给予益气活血中药21 g/kg体质量[5-6]。各干预药物均溶于无菌蒸馏水中，在保证药物剂量的前提下，调整浓度使每只动物给药容积均为10 mL/（kg・d）。假手术组和模型组每日以相同容积无菌蒸馏水灌胃。连续灌胃28 d。
2.3 标本采集
称取大鼠体质量，用1%戊巴比妥钠麻醉，剪开腹腔，从腹主动脉取血，分离出血清待测。然后剪断肋骨和胸肌，暴露胸腔取出心脏，用生理盐水洗去血污，剔除血管、脂肪等非心肌组织，从左心室最大横径处切开，将切好的下半部分心脏放入预先准备的4%多聚甲醛液中固定备用，进行常规组织学方法处理，制作石蜡切片。据各组大鼠在实验过程中的成活数量分别观察第7、28日2个时间点指标的变化情况。
2.4 心肌病理形态学观察
将心肌组织用不同浓度酒精梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡、包埋、切片，脱腊，二甲苯透明，HE常规染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封固，光学显微镜观察。
2.5 心肌毛细血管密度
石蜡切片脱蜡至水；3%过氧化氢室温孵育8 min，以消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水冲洗3次（每次2 min），电炉加热沸腾后断电，间隔7 min，反复2次，冷却后PBS（pH 7.2～7.6）洗涤2次，滴加5%牛血清白蛋白封闭液，室温20 min，甩去多余液体，滴加CD34一抗（浓度为1∶100），4 ℃过夜，第2日早晨滴加生物素山羊抗小鼠IgG，室温20 min，PBS洗3次（每次2 min），滴加SABC，室温20 min，PBS洗4次（每次5 min），DAB显色，取1 mL蒸馏水，A、B、C试剂各加1滴，混匀后加至切片，室温显色，镜下控制时间，蒸馏水冲洗，苏木素轻度复染，1～2 s即可，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。
2.6 免疫组化染色法检测周细胞
石蜡包埋，切片（厚度4 ?m，每只鼠各取3张切片），脱蜡，高温高压抗原修复，喷气后计时2 min，自然冷却，水洗。4 ℃下于1∶300 α-SMA单克隆抗体孵育24 h，每张切片滴加50 ?L EnVisionTM试剂，室温下孵育30 min。滴加新鲜配制的显色剂（DAB），苏木素复染。显微镜下观察，胞浆显棕黄色者为阳性细胞。按下法计数：先在100×视野下随机选择血管密度高的5个区和血管密度低的5个区作为计数部位，后在400×视野下计数微血管旁胞质出现棕黄色颗粒的周细胞数，每只大鼠计数20个视野，最后以平均每个视野（400×）的周细胞数表示。小动脉平滑肌细胞亦为α-SMA阳性表达，根据血管壁厚度及结构可与周细胞相区别，此类阳性细胞不在计数范围内。
2.7 血清内皮素-1、一氧化氮测定
采用双抗体夹心ELISA法测定各组大鼠血清ET-1、NO的变化，具体方法严格按试剂盒说明操作。根据各组大鼠在实验过程中的成活数量分别观察第7、28日2个时间点指标的变化情况。
3 统计学方法
用SPSS16.0统计软件进行分析。一般资料采用描述性分析，计量资料以―x±s表示，计数资料以频数及百分数描述；多个样本计数资料用χ2检验，计量资料符合正态性分布采用t检验，如不符合正态性分布采用非参数检验，比较各项指标在治疗前后之间的差异，多组间差异性统计采用方差分析，若方差不齐，则用Games-Howell分析，双侧检验。P
4 结果
4.1 模型建立情况
采用冠状动脉结扎法致大鼠急性心肌梗死后，肢导Ⅱ导联心电图ST段呈弓背向上抬高，缺血心肌很快变苍白色。共手术100只，造模成功81只，死亡19只，其中手术中死亡8只，急性心肌梗死造模成功后24 h内死亡3只，给予药物治疗后死亡3只，注射麻药后行心脏超声检查后死亡5只，死亡原因为呼吸停止、室颤和大出血，造模成功率81.0%。第7日观察大鼠42只，第28日观察大鼠39只。
4.2 各组大鼠心肌形态学观察
第7日：假手术组大鼠心外膜未见纤维素渗出及未见炎细胞浸润；模型组心肌梗死区炎症反应明显，有泡沫状组织细胞聚集，大量中性粒细胞浸润，心肌纤维断裂、排列紊乱，坏死的心肌组织由新生的肉芽组织取代；梗死区边缘有充血、出血及炎细胞带，心外膜有炎性及纤维素性渗出物。培哚普利组病理改变与模型组相似，但病变范围较模型组明显减小。通心络组病理改变与模型组相似，但病变范围较模型组明显减小，较培哚普利组病变范围小。益气活血组病理改变与模型组相似，但病变范围较模型组明显减小，较培哚普利组及通心络组病变范围较小。见图1。
第28日：假手术组大鼠心外膜未见纤维素渗出及未见炎细胞浸润。模型组大鼠心肌梗死区由纤维母细胞、纤维细胞及致密的胶原纤维束组成，呈束状或平行排列，胶原纤维束之间有极少残存的心肌组织，炎性细胞浸润明显减少，地图状瘢痕组织形成；心室腔扩大，室壁变薄。培哚普利组大鼠病理改变与模型组相似，但病变范围较模型组明显减小，且梗死区有岛状或细带状的心肌组织。通心络组大鼠病理改变与模型组相似，但病变范围较模型组明显减小，且梗死区有岛状或细带状的心肌组织，但较培哚普利组病变范围大。益气活血组大鼠病理改变与模型组相似，但病变范围较模型组明显减小，且梗死区有岛状或细带状的心肌组织，但较培哚普利组病变范围大。见图2。
假手术组 模型组
益气活血组 培哚普利组 通心络组
图1 第7日HE染色大鼠心肌病理形态（×50）
假手术组 模型组
益气活血组 培哚普利组 通心络组
图2 第28日HE染色大鼠心肌病理形态（×100）
4.3 益气活血中药对心肌梗死大鼠血清内皮素-1、一氧化氮水平的影响
与假手术组比较，模型组大鼠血清ET-1含量明显升高，NO水平下降（P
表1 各组大鼠血清ET-1、NO水平比较（―x±s，pg/mL）
组别 术后第7日 术后第28日
只数 ET1 NO 只数 ET1 NO
假手术组 10 5.37±1.06 31.12±2.57 9 6.38±1.73 30.38±4.00
模型组 7 13.67±1.68## 19.41±3.24## 7 14.60±2.38## 16.23±3.05##
益气活血组 9 8.06±1.21** 41.71±4.43** 8 8.97±1.07** 40.11±5.51**
培哚普利组 8 10.65±1.12** 33.02±2.68** 8 7.30±1.37** 45.26±6.60**
通心络组 8 9.87±0.73** 37.76±3.34** 7 9.57±1.57** 35.06±5.20**
注：与假手术组比较，##P
4.4 益气活血中药对心肌梗死大鼠毛细血管密度的影响
在病理图像分析系统下测定各组大鼠心肌梗死边缘区平均毛细血管密度（MCD）。第7日：模型组较假手术组心肌梗死边缘区MCD明显降低（P
表2 各组大鼠心肌MCD比较（―x±s）
组别 n 第7日 第28日
假手术组 20 612.79±33.35 611.11±25.67
模型组 20 533.67±20.27## 493.27±19.38##
益气活血组 20 1178.50±33.27** 1051.30±30.12**
培哚普利组 20 1010.10±33.27** 1099.30±33.98**
通心络组 20 1094.30±33.12** 974.75±35.41**
4.5 益气活血中药对心肌梗死大鼠毛细血管周细胞计数影响
第7日：模型组较假手术组心肌梗死边缘区周细胞计数明显增加，益气活血中药组、培哚普利组、通心络组与模型组比较，梗死边缘区的周细胞计数减少（P
表3 各组大鼠心肌周细胞计数比较（―x±s，个）
组别 n 第7日 第28日
假手术组 20 0.8±0.84 1.2±0.84
模型组 20 8.2±1.30## 14.0±1.58##
益气活血组 20 4.2±0.84* 4.4±1.14**
培哚普利组 20 5.8±0.84** 3.6±1.14**
通心络组 20 4.4±0.55** 5.8±1.30**
注：与益气活血组比较，P
P
5 讨论
临床研究表明，急性心肌梗死患者多存在“气虚血瘀”的中医病理[8]。实验的中药组方中，生晒参、黄芪大补元气、广益五脏，针对气虚的主要病机；三七、川芎、当归为臣，活血通络、止血消瘀。诸药相合，气行则血行，血行则气实，诸药合用，标本兼治，相得益彰，共奏益气活血、化瘀通络之功效。
冠脉微血管结构完整性与功能正常，是确保心肌收缩力储备和局部功能恢复的先决条件，是心肌存活的必备条件，当发生微小动脉和阻力血管的功能及结构变化时，冠脉血流速率和血流储备的变化可引起心肌缺血。低灌注梗死区和正常心肌之间的慢复流区域毛细血管内皮肿胀、突出甚至脱落，受周边的坏死组织压迫，毛细血管内皮细胞功能和结构完整性受损，心肌毛细血管周细胞功能失调。血管壁在结构上由血管内皮细胞和血管周围细胞组成，它们分别构成血管的内外壁。周细胞又叫壁细胞，可以分化为巨噬细胞、脂肪细胞、软骨细胞、平滑肌细胞等，具有收缩能力，从而调节微循环的灌流量和通透性[9-10]。
有研究显示，早期心肌缺血缺氧性坏死中周细胞数量在4 h后明显增多，12 h后开始下降，48 h后显著低于正常水平，推测周细胞作为心肌中的间质细胞可能是心肌纤维化发生发展中的主要效应细胞[11]。本实验结果表明，使用益气活血中药后，毛细血管周细胞的计数减少，与模型组比较差异有统计学意义（P
本实验结果显示，益气活血组较模型组心肌梗死边缘区域MCD明显增加，可见周细胞对毛细血管生长起到调控的作用。研究发现新生血管的生长和维持主要由周细胞的募集和分化所推动[12-13]。周细胞募集并伴随发生基底膜重塑[14-15]。可见，周细胞的募集对血管新生是必不可少的。
此外，益气活血中药可提升内皮分泌NO水平，并相应降低ET-1水平。NO和ET-1是由血管内皮细胞分泌的一对作用相反的血管活性分子，NO的含量与生物活性的变化能够反映内皮功能的状态。与益气活血组模型组比较，ET-1下降，NO升高，说明益气活血中药具有保护血管内皮功能的作用。
总之，益气活血中药可以通过降低心肌梗死大鼠毛细血管周细胞计数，维持血管的相对完整性，改善局部微循环的血流，减少梗死面积，并促进血管新生，调节NO/ET-1的平衡，从而达到改善局部心肌血供的目的。
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（收稿日期：2013-03-11，编辑：华强）