冬凌草甲素诱导三阴乳腺癌MDA―MB―231细胞凋亡及对细胞内活性氧水平的影响

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[摘要] 冬凌草甲素是从中药冬凌草Rabdosia rubescens中分离得到的一种贝壳杉烯二萜类的天然有机化合物，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等多种生物活性。该实验观察冬凌草甲素对三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。采用MTT法检测冬凌草甲素对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用，PI单染、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术分析冬凌草甲素对MDA-MB-231细胞凋亡的影响，活性氧（ROS）试剂盒检测细胞内ROS水平的变化，Western blot分析PARP，Bcl-2，caspase-3蛋白的表达情况。结果表明，冬凌草甲素对乳腺癌MDA-MB-231细胞具有明显的凋亡诱导作用，显著升高细胞内的ROS水平，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并促进caspase-3及其底物PARP的切割。提示，冬凌草甲素诱导MDA-MB-231细胞凋亡的作用可能与升高细胞内ROS水平、下调Bcl-2的表达以及激活caspase-3相关。

[关键词] 乳腺癌； 冬凌草甲素； 细胞凋亡； 活性氧

[Abstract] Oridonin， which is an ent-kaurene diterpenoid isolated from traditional Chinese medicine Rabdosia rubescens， displays various bioactivities， including anti-inflammation， anti-bacteria and anti-tumor. This study aimed to investigate the effect of oridonin on apoptosis of triple-negative breast cancer mda-mb-231 cells and its underlying mechanisms. The inhibitory effect of oridonin on proliferation of MDA-MB-231 cells was measured by MTT assay； Apoptosis was analyzed by flow cytometry with PI staining and Annexin V-FITC/PI staining； Intracellular reactive oxygen species （ROS） level was determined by ROS detection kit， and expressions of PARP， Bcl-2， caspase-3 were analyzed by Western blot. The results showed that oridonin exhibited a significant effect in inducing apoptosis of MDA-MB-231 cells， enhancing intracellular ROS level， down-regulating expression of Bcl-2 protein， and promoting cleavage of caspase-3 and its substrate PARP. These results indicated that the apoptosis-inducing effect of oridonin on MDA-MB-231 cells might be correlated with increase of intracellular ROS level， down-regulation of Bcl-2 protein and activation of caspase-3.

[Key words] breast cancer； oridonin； apoptosis； reactive oxygen

乳腺癌是世界范内严重危害女性健康与生命的恶性肿瘤，其发病率呈逐年增长的趋势。近年来尽管其治疗取得了长足的进步，但乳腺癌在发展中国家的发病率依然快速增长[1]。目前，外科手术、放疗和化疗是乳腺癌最主要的治疗手段。雌激素受体、孕激素受体、人类表皮生长因子受体2（HER2）均为阴性表达的乳腺癌，为三阴性乳腺癌（TNBC），该亚型的乳腺癌占乳腺癌病例数的12%～24%[2]。TNBC具有恶性程度高、侵袭性强、预后差等特征，并对内分泌治疗和抗HER2的靶向治疗均不敏感[3-4]。因此，寻找新的作用机制的治疗药物对TNBC的治疗具有重要意义。

冬凌草甲素是从中药冬凌草Rabdosia rubescens中分离得到的一种贝壳杉烯二萜类的天然有机化合物，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等多种生物活性[5]。其中，抗肿瘤作用的研究受到了广泛关注，研究发现，冬凌草甲素对肺癌、结肠癌、胰腺癌等显示了良好的抗肿瘤效应[6-8]，且毒副作用较低，尚未见对骨髓、肝脏、肾脏、心脏等重要脏器有明显损伤作用的报道。该化合物以其显著的抗肿瘤活性及低毒副作用等优势，显示了作为新型抗肿瘤药物或辅助抗肿瘤药物的应用前景[9-10]。但冬凌草甲素抗肿瘤作用的具体机制并不明确。近年来，有研究表明某些化疗药物或化合物可通过升高肿瘤细胞内活性氧（ROS）水平杀伤肿瘤细胞[11-12]。本实验将从ROS出发，探讨冬凌草甲素诱导三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人乳腺癌MDA-MB-231细胞购自中国科学院上海细胞库。于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，5%CO2细胞培养箱中常规培养。

1.2 试剂 DMEM培养液（Hyclone公司）；胎牛血清（Gibco公司）；冬凌草甲素（Merck公司），以二甲基亚砜（DMSO）溶解；MTT，PI（Sigma公司）；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（索莱宝公司）；ROS探针DCFH-DA，0.25%胰蛋白酶（碧云天生物技术研究所）；PARP，Bcl-2抗体（Santa Cruz公司）；caspase-3抗体（Abcam公司）；β-actin，HRP标记的山羊抗兔IgG（博士德公司）。

3 讨论

ROS依据其分子类型的不同可分为非离子型和离子型，包括过氧化氢、羟自由基、超氧阴离子自由基、单线态氧、烷过氧化自由基、脂过氧化自由基等。细胞内氧化还原状态的平衡对于细胞的存活及功能至关重要，低水平的ROS在维持细胞内稳态中发挥了重要作用[13]。研究表明，在肿瘤的发生发展进程中，细胞内的氧化还原状态通常发生异常变化，引起肿瘤细胞内ROS水平的升高[14]。升高的ROS不仅使肿瘤细胞更易于发生基因突变，且使肿瘤细胞对异常升高的ROS较正常细胞更为敏感[15]。许多抗肿瘤化合物可通过升高细胞内ROS诱导肿瘤细胞发生凋亡[16-17]。通过调节Bcl-2蛋白家族的磷酸化和泛素化，ROS可上调促凋亡蛋白的表达、下调抗凋亡蛋白的表达，进而诱导细胞凋亡[18]。Hildeman等报道，细胞内ROS的升高可通过下调Bcl-2蛋白的表达引起线粒体膜电位的下降，从而诱发细胞凋亡[19]。本实验以DCFH-DA为细胞内ROS探，检测到冬凌草甲素可升高MDA-MB-231细胞内ROS水平，同时Western blot实验结果显示冬凌草甲素可下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，提示其可能通过升高细胞内ROS而下调Bcl-2的表达参与细胞凋亡的诱导。

细胞凋亡是受死亡信号调节并伴随天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（caspases）活化的一种自主而有序的细胞死亡形式，是多基因严格调控的过程[20]。Bcl-2蛋白家族在细胞凋亡过程中起着关键性作用，分为抗凋亡成员和促凋亡成员两大类，前者包括Bcl-2，Bcl-XL，Mcl-1等，可保护线粒体膜的完整性；后者包括Bax，Bak，Bad等，可促使多种凋亡诱导因子的释放，通过激活caspases触发细胞凋亡[21]。caspases蛋白酶家族在细胞凋亡过程中发挥着重要作用，其中caspase-3是介导细胞凋亡的关键分子，该分子被上游信号Bcl-2等激活后可引发酶促级联反应，通过切割其底物白PARP，导致细胞凋亡的发生[22]。本实验中，冬凌草甲素处理MDA-MB-231细胞24 h，可下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并引发caspase-3和PARP的切割，提示冬凌草甲素可能通过提高线粒体膜的通透性、激活caspase-3而诱导细胞凋亡。

本实验结果表明，冬凌草甲素可诱导MDA-MB-231细胞凋亡，其机制可能与升高细胞内ROS水平、下调Bcl-2的表达并激活caspase-3相关，但ROS下调Bcl-2表达的分子机制尚需进一步研究。

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