HPLC测定人尿液三苯双脒次级代谢物对苯二甲酸浓度

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【摘要】

目的建立测定人尿液三苯双脒次级代谢物对苯二甲酸（tpa）浓度的高效液相色谱法（hplc）。方法 以阿魏酸为内标（internal standard, is），志愿者尿样稀释后经ultimate xb?c18柱（4.6mm×200mm，5μm）、流动相甲醇－1%醋酸（35∶65，v/v）分离，在检测波长为240nm、流速为 0.8ml/min、柱温为30℃条件下采用hplc分析。结果在1～400μg/ml内，tpa与is的峰面积比值与浓度线性关系良好（r=0.9954），定量下限为1μg/ml，低、中、高浓度的相对回收率分别为（106.0±4.4）%、（107.4±4.2）%和（108.5±2.4）%，批内和批间相对标准偏差（rsd）小于8%。结论方法符合生物样品分析要求，可用于三苯双脒次级代谢物tpa尿液浓度的测定。

【关键词】 三苯双脒 对苯二甲酸 高效液相色谱法 尿

terephthalic acid by hplc

xu jie1,2, yuan gui?yan1, wei chun?min1, wang ben?jie1, guo rui?chen1

(1． institute of clinical pharmacology， qilu hospital of shandong university， jinan 250012， china;

2．department of bioengineering， zibo vocational institute， zibo 255013， shandong, china)

to develop a hplc method for determination of tribendimidine metabolite terephthalic acid (tpa) concentration in human urine. methods diluted urine was separated on the ultimate xb?c18 column (4.6mm×200mm, 5μm), eluted with methanol and 1% glacial acetic acid (35∶65, v/v) at 0.8ml/min and 30℃, and detected at 240nm with ferulic acid as an internal standard (is). results a good linearity was obtained from 1 to 400μg/ml (r=0.9954). the lower limit of quantitation (lloq) was 1μg/ml. the relative recoveries were (106.0±4.4)%, (107.4±4.2)% and (108.5±2.4)% at 3, 25 and 200μg/ml, and the intra? and inter?batch relative standard deviations (rsd) were less than 8% for all quality control samples. conclusion the developed hplc method is proved to meet the requirements of biological sample analyses, and is appropriate for determination of urinary tribenmidine metabolite?tpa in human urine.

key words: tribendimidine; terephthalic acid; high performance liquid chromatography; urine

三苯双脒（tribendimidine）是新型广谱驱肠虫药［1?3］，化学名为n,n′?双［4′?(1?二甲氨基乙亚氨基)苯基］ ?1,4?苯二甲亚胺，po后于体内迅速分解为对?（1?二甲氨基乙亚氨基）苯胺（p?(1?dimethylamino ethylimino) aniline，dadt）和对苯二甲醛（1, 4?phthaladehyde），对苯二甲醛经过体内酶氧化，迅速转化为对苯二甲酸（terephthalic acid，tpa）自尿中排泄；血中无对苯二甲醛检出。国内外文献多报道三苯双脒临床应用或药效学，鲜有其人体内处置过程［4］。文献报道［5?6］人尿液对苯二甲酸测定中，尿样需经高氯酸沉淀蛋白，乙酸乙酯提取，流动相中加入离子对试剂进行分离，操作较复杂。本研究建立了一个方便可行、定量准确的人尿液 tpa浓度的hplc测定方法，适合人体三苯双脒次级代谢物对苯二甲酸排泄动力学研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 tpa对照品（批号wf20070717，含量≥99%）购自国药集团化学试剂有限公司；内标阿魏酸(ferulic acid, 批号0773?9910，供含量测定用）购自中国药品生物制品检定所；三苯双脒肠溶片（200mg/片，批号0505226），由山东新华制药股份有限公司提供；甲醇购自美国baker公司（色谱纯，含量100.0%）；冰醋酸购自美国tedia公司（色谱纯，含量≥99.7%）；氢氧化钠购自山东化工研究院（分析纯，含量≥96.0%）；水为市售娃哈哈纯净水。

1.1.2 仪器 美国waters allience高效液相色谱仪，配有waters 2695 separation module，waters 2996二极管阵列检测器，empower build 1154色谱工作站；sorvall biofuge primo离心机，购自美国科峻仪器公司；xw?80a型旋涡混合器，购自上海精科实业有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱 ultimate xb?c18柱（4.6mm×200mm，5μm）；流动相甲醇－1%醋酸（35∶65，v/v）；检测波长240nm；流速0.8ml/min；柱温30℃。

1.2.2 tpa系列对照品溶液 取tpa对照品约0.1g，精密称定，加1%氢氧化钠溶液溶解并稀释制成浓度为2mg/ml的对照品储备液，4℃冰箱保存备用。以水稀释配成1000、500、100、20和10μg/ml的tpa系列对照品溶液。

1.2.3 is溶液 取阿魏酸约0.25g，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成浓度为0.5mg/ml的is溶液，4℃冰箱保存备用。

1.2.4 尿样处理 取人尿液适量，5000r/min离心5min，0.45μm针筒过滤器过滤，取滤液60μl，加入is溶液70μl和水770μl，涡旋1min，取20μl进样。以内标法计算尿液中tpa浓度。

1.2.5 受试者选择及尿样采集 选择符合入选标准的16名男性健康志愿者，试验前签署知情同意书。志愿者随机分为3组，试验前禁食一夜，于次日早晨7点分别空腹口服200mg（5人）、 400mg（6人）和600mg（5人）三苯双脒肠溶片，200ml温开水送服，服药1h后定时定量（100ml/h）饮水，2h后进统一低蛋白、低脂肪早餐。早、中、晚餐统一进食。收集服药前和服药后0～2，2～4，4～6，6～8，8～10，10～12，12～24h的尿液，记录尿液体积，取10ml 离心后-20℃保存，备测。

1.3 统计学处理 分析方法精密度和准确度试验数据经excel 2003软件计算得到。志愿者不同时间段的尿药浓度及尿液体积经das2.0实用药代动力学程序（残余尿药量法）计算三苯双脒次级代谢物tpa经尿排泄速率常数（elimination rate constant, ke）和半衰期（half?life time, t1/2）。

2 结 果

2.1 专属性 取尿液，按“1.2.4”项下操作。tpa和is保留时间分别为9.8min和12.0min，尿中内源性物质不干扰tpa测定。对照品溶液、空白尿样、空白尿样加对照品和is及志愿者给药后尿样加is色谱图见图1。

2.2 标准曲线 取空白尿液，分别加入tpa系列对照品溶液适量，配制浓度为1、2、10、25、100、250、400μg/ml的tpa尿样系列。按“1.2.4”项下操作，每个浓度测定5次。以尿样中tpa浓度（x，μg/ml）为横坐标，tpa与is峰面积比值y为纵坐标，采用加权（1/c2）最小二乘法［7］进行线性回归运算，得回归方程y=2.68e-002x-1.47e-003，r=0.9954，r2=0.9909。在1～400μg/ml内，tpa与 is的峰面积比值与浓度线性关系良好，定量下限为1μg/ml。

2.3 精密度和准确度 分别用空白尿液配制浓度为3、25和200μg/ml的低、中、高3个浓度的质控样品，按“1.2.4”项下操作，每个浓度5样本于1d内测定，或每日测定1次，连续3d（每日为一批）。质控样品与标准曲线同时进行，以当日标准曲线计算质控样品浓度，计算批内、批间相对标准偏差（relative standard deviation，rsd），评价方法精密度。根据测定浓度计算相对回收率，评价方法准确度。精密度结果见表1。低、中、高3个浓度相对回收率分别为（106.0±4.4）%，（107.4±4.2）%和（108.5±2.4）%；rsd分别为4.1%、3.9%和2.2%。表1 低、中、高3个浓度的精密度

3 讨 论

本研究建立了阿魏酸为is的人尿液tpa浓度hplc测定法，该法简便、快速、灵敏、准确，符合生物样品分析要求，适合人体三苯双脒次级代谢物tpa排泄动力学研究。

本研究尿样无须沉淀蛋白，经离心、过滤和稀释后直接进样，预处理方法简单，回收率高，干扰少，重复性好。分离机制采用离子抑制色谱，流动相为甲醇－1%醋酸（35∶65，v/v），无需特殊离子对试剂，杂质峰与tpa分离效果良好。本研究用内标法定量，较文献报道［5?6］的外标法误差小。is 曾试用阿司匹林、苯甲酸、水杨酸和甘草次酸，分离效果或分析时间不理想。以阿魏酸为is，尿液中杂质峰与tpa和is分离良好，且保留时间适中，有利于提高测定效率。

三苯双脒口服后于体内迅速分解为dadt和对苯二甲醛，对苯二甲醛经体内酶迅速氧化成tpa自尿中排泄，血中无对苯二甲醛检出。作为国家一类新药，三苯双脒体内处置过程尚未完全清楚，其参与酶类、肠道菌群或反应类型有待进一步研究。文献报道［8］tpa经肾排泄存在分泌和重吸收机制，可能导致 tpa尿累积排泄率有较大个体差异，但尚需进一步研究证实。

【参考文献】

［1］ 〖zk(#]xiao shu?hua, wu hui?ming, marcel t, et al. tribendimidine: a promising, safe and broad?spectrum anthelmintic agent from china［j］. acta tropica, 2005, 94(3):1?14.

［2］ 曹汉钧, 孙凤华, 钱益新, 等.新药三苯双脒治疗钩虫感染临床观察［j］. 中国寄生虫病防治杂志, 2000, 13(3):184?186.

［3］ 吴中兴, 方悦怡, 刘宜升. 新药三苯双脒肠溶片治疗肠道线虫感染的效果观察［j］. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2006, 24(1):23?26.

［4］ yuan gui?yan, wang ben?jie, wei chun?min, et al. lc?ms determination of p?(1?dimethylamino ethylimino)aniline: a metabolite of tribendimidine in human plasma［j］. chromatog, 2008, 68(7):139?142.

［5］ 姚宏伟, 邱清, 吴仲华,等. 紫外分光光度法测定尿中对苯二甲酸［j］. 中华劳动卫生职业病杂志, 1995, 13(6):367?368.

［6］ 戴建国, 王沐沂, 龚楠,等. 高效液相色谱法测定作业工人尿中对苯二甲酸含量［j］. 中国公共卫生, 1999, 15(9):844?845.

［7］ 钟大放. 以加权最小二乘法建立生物分析标准曲线的若干问题［j］. 药物分析杂志, 1996, 16(5):343?346.

［8］ tremaine l m, quebbemann a j. the renal handling of terephthalic