三角梅ISSR反应体系的建立和优化
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[摘要]对影响三角梅issr-PCR扩增反应的各个参数进行优化,建立适合三角梅的ISSR反应体系:PCR反应体积为20µL,其中10×buffer(含Mg2+)2.0µL,dNTP 250 µmol/L,Taq酶1.0U,引物0.3µmol/L,模板DNA20ng。扩增程序为:94℃预变性5min;94℃变性1min,51.6℃退火1min,72℃延伸2min,34个循环;最后72℃延伸7min。该反应体系标记点位清晰、稳定、重复性好,适宜三角梅ISSR分析,为应用ISSR技术鉴定三角梅种质资源、分子标记辅助选择育种及其遗传多样性研究奠定了基础。
三角梅(Bougainvillea spectabilis Willd)又名九重葛、毛宝巾、勒杜鹃,在我国已有100多年的栽培历史,品种丰富。我国部分研究者在同工酶水平上对三角梅品种进行亲缘关系分析但存在难以解释之处[1],至今仍有分类标准不统一、分类手段有一定的局限性,所得分类结果不一致以及同名异物、同物异名等问题,从而给生产、园林应用、交流等方面带来诸多困难。而三角梅有关分子标记方面的研究仍是空白,因此利用分子标记技术进行三角梅的分类、品种鉴定等研究显得尤为重要。
ISSR(简单重复序列间隔区,Inter-Simple Sequence Repeat)是由Zietkiewicz等于1994年创建的一种简单序列重复区间扩增多态性的分子标记[2]。ISSR具有操作简单,标记重复性好,稳定程度高,多态性丰富,DNA用量少,成本低等优点。ISSR标记已广泛地用于遗传多样性、品种鉴定、系统发育、基因定位、分子标记育种等方面[3]。
试验对影响三角梅ISSR-PCR扩增反应的各个参数进行优化,建立适合三角梅的ISSR-PCR反应体系,为应用ISSR分子标记技术进行三角梅种质资源研究、分子育种等创造条件。
1材料与方法
1.1 材料
试验材料为三角梅“亮叶紫花”品种嫩叶。取材自厦门植物园。
1.2 试剂和仪器
ISSR引物序列源自加拿大的University of British Columbia,购自上海生物工程技术服务有限公司。Taq酶等试剂购自大连宝生物(TAKARA)有限公司。梯度PCR仪Tgradient为Biometra公司产品。
1.3 方法
1.3.1三角梅基因组DNA的提取
采用改进的CTAB法[4]提取基因组DNA。DNA经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析,用TU-1810紫外分光光度计测定OD260/ OD280的吸光值,确定DNA 浓度和质量。DNA在-20℃保存备用。
1.3.2 ISSR-PCR反应体系参数的优化
参照其它物种ISSR反应的条件[5~7]以及预备试验的结果,初步设定各成分的用量:ISSR-PCR反应体积为20µL,10×buffer(含Mg2+)2.0µL,模板DNA20ng,Taq酶1.0U,引物0.3µmol/L,dNTP200µmol/L。PCR扩增反应程序是:94℃预变性5min;94℃变性1min,52℃退火1min,72℃延伸2min,38个循环;72℃延伸7min。PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳分析上,100V稳压电泳2.0h,EB染色,凝胶成像系统观察、拍照。
经过初步的引物筛选,选用引物UBC814(CTC TCT CTC TCT CTC TA)进行PCR反应体系的建立和优化。对影响ISSR-PCR扩增的主要参数设置了不同的梯度:采用梯度PCR模式,以TM值52.18为中心,生成了48.1℃、49.2℃、50.4℃、51.6℃、52.8℃、54℃、55.2℃ 7个退火温度梯度;设计10、20、30、50、75、100、150ng 7个模板DNA用量梯度;0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5U 7个Taq酶用量梯度;0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7µmol/L 7个引物浓度梯度;100、150、200、250、300、350、400µmol/L 7个dNTP浓度梯度以及31、34、37、40、43、46、49 7个循环数。
2 结果与分析
2.1 DNA检测
用1%琼脂糖凝胶电泳,检测其完整性,由图1的结果可以看到1条整齐的条带,无弥散的荧光出现,加样孔清晰,表明所提取的DNA样品较纯,基本没有多糖等杂质,无降解和RNA污染。DNA样品在紫外分光光度计测定OD260、OD280,OD260/OD280比值在1.65~1.85之间,符合PCR的要求。
M:15000bp DNA ladder;1～5为三角梅样品
图1三角梅DNA电泳图
2.2 退火温度对扩增结果的影响
退火温度不仅与引物序列有关,还与物种DNA的序列有密切关系,因此在进行ISSR扩增优化之前确定引物的退火温度非常重要[8]。退火温度不同,产生错配的程度也不同,通常较低的温度在保证引物与模板结合稳定性的同时,也会使引物与模板之间未完全配对的一些位点间得到扩增,即产生一定的错误扩增。因此,在允许的范围内,选择较高的退火温度可减少引物和模板之间的非特异性结合,提高PCR反应的特异性[9]。从ISSR随机引物UBC801～UBC900中挑取若干个引物进行PCR扩增的预备,从中选择UBC814 作为体系优化的引物。由图2中可见,温度低于50.4℃时,条带减少并模糊;温度高于52.8℃时,片段减少,51.6℃时,谱带最清晰,多态性最好,由此确定引物UBC814的最佳退火温度为51.6℃。
M:2000bp DNA ladder;1～7为退火温度
分别是48.1、49.2、50.4、51.6、52.8、54、55.2℃
图2退火温度对扩增结果的影响
2.3 模板DNA用量对扩增结果的影响
PCR反应中对模板DNA浓度要求的范围通常较宽,但研究表明,模板DNA浓度过低,分子碰撞的概率低,偶然性大,扩增产物无或不稳定;模板量过高,会相应增加非特异性产物的扩增[10]。图3是模板DNA不同用量的扩增结果。在20µL反应体系中,添加10～30ng 模板DNA的效果最佳,DNA浓度高于50ng时,扩增出的条带减少,在20～30ng时条带最清晰。从节约模板和扩增效果出发,20ng的模板DNA浓度用于三角梅ISSR-PCR扩增为最佳选择。
M:2000bp DNA ladder;1～7模板DNA用量
分别是10、20、30、50、75、100、150ng
图3模板DNA用量对扩增结果的影响
2.4 Taq酶用量对扩增结果的影响
Taq酶使用量直接影响扩增反应的成功与否,使用高浓度的Taq酶不仅提高了成本,而且也容易产生非特异扩增产物;而Taq酶浓度过低时,则会导致产物的合成效率下降。Taq酶单位的变化也对条带的数量和强弱影响较大。由图4可见,随着所加Taq酶单位的逐渐增多,条带的数量开始急剧减少,亮度也开始逐渐减弱。当Taq酶在1.0U～2.0U时条带较清晰稳定,从经济角度考虑,选择1U的Taq酶用量。
M:2000bp DNA ladder;1～7Taq酶浓度分别是
0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5U
图4Taq DNA聚合酶用量对扩增结果的影响
2.5 随机引物浓度对扩增结果的影响
引物浓度的变化实质上是改变了引物和模板配对的几率,从而影响扩增结果。引物浓度过低,导致引物和模板的结合率降低,使扩增反应过早终止,扩增条带很弱,甚至得不到可观察的结果;引物浓度过高,引物与模板的非特异性配对增多,出现非特异性扩增[11]。由图5看出,20µL反应体系中,引物浓度低于0.2µmol/L 时,分子量相对较小的条带较弱,引物浓度高于0.4µmol/L 时,分子量相对较大的条带较弱,当浓度为0.3µmol/L时,条带较清晰稳定。因此选择0.3µmol/L为反应体系的最佳引物浓度。
M:2000bp DNA ladder;1～7引物浓度
分别是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7µmol/L
图5引物浓度对扩增结果的影响
2.6 dNTP浓度对扩增结果的影响
dNTP作为扩增的底物,直接影响PCR扩增。底物浓度过高,会导致PCR错配,从而使扩增出现非特异性扩增,此外过量的引物浓度还会导致引物二聚体的形成;底物浓度过低会影响合成效率,甚至会因过早的消耗而使产物单链化,影响扩增效果[12]。由图6可知,dNTP的浓度低于200µmol/L,扩增产物明显减少或扩增出来的条带模糊不清,当dNTP的浓度高于300µmol/L时,扩增产物减少。根据条带出现情况,选择250µmol/L为反应体系中dNTP的浓度。
M:2000bp DNA ladder;1～7dNTP浓度分别
是100、150、200、250、300、350、400µmol/L
图6dNTP浓度对扩增结果的影响
2.7 循环数对扩增结果的影响
PCR的循环次数决定产量,次数太少,产物量极低,次数太多,达到反应平台后,循环不会使产物明显增加,反而引起非特异性扩增。不同物种适宜的循环次数不同[13],如小苍兰[3]为35次,腊梅[10]为38次。循环数对三角梅ISSR-PCR扩增的影响见图7。试验结果表明循环数低于34次时,扩增谱带较弱,多态性降低;循环数过高会使一些谱带亮度过强,掩盖了弱带。34个循环扩增的谱带清晰,多态性好。
M:2000bp DNA ladder;1～7循环数
分别是31、34、37、40、43、46、49
图7循环数对扩增结果的影响
2.8 优化反应体系的确定
通过试验,对三角梅ISSR-PCR反应体系进行了优化,适合三角梅ISSR分析的反应体系是:20µL体积中,模板DNA20ng,引物0.3µmol/L,dNTP 250µmol/L,Taq酶1.0U,10×buffer(含Mg2+)2.0µL;PCR扩增程序是94℃预变性5min;94℃变性1min,51.6℃退火1min,72℃延伸2min,34个循环;最后72℃延伸7min。利用此优化体系,在51.6℃的退火温度下,对三角梅六个样品进行ISSR-PCR扩增。由图8可知,ISSR-PCR扩增得到较为清晰稳定的ISSR谱带,并具有较多条带。
M:2000bp DNA ladder;1～6为三角梅6个品种
图8 引物UBC814对三角梅6个样品的ISSR扩增结果
3讨论
由于ISSR引物序列较长,退火温度较高,具有RAPD的操作简单和SSR的多态性好的优点,然而它的重复性比RAPD高,在引物设计上比SSR技术简单得多,无需预先知道DNA序列即可用引物对其进行扩增[14]。ISSR分子标记具有操作简单,标记重复性好,稳定程度高,多态性丰富等优点,是一种非常理想的检测三角梅种内遗传变异的分子标记。
ISSR分子标记是基于PCR的标记,其反应结果受到诸如退火温度、循环次数、模板DNA质量及浓度、Taq酶用量、引物浓度、dNTP浓度等多种因素的影响。因此,为了获得重复性和可靠性较高的ISSR谱带,在研究时都应建立起合适的反应体系并对其进行优化,特别是第一次在某种生物上应用该项技术的时候。同时还应注意尽可能的使用统一厂家的药剂和同一仪器设备才能保证分析结果的重复性和可靠性。
本试验采用单因素试验设计,逐一研究各因素不同处理水平对ISSR-PCR的影响,比较系统和精细地研究了各主要因子的影响,建立了三角梅ISSR-PCR优化反应体系。同时,本研究为三角梅种质资源分析、遗传图谱构建、遗传多样性分析、分子标记辅助育种等研究奠定了良好的基础。
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