酶标仪在粮食真菌毒素检测中的应用
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摘要:真菌毒素含量测定是粮食卫生检测中的重要检测项目之一,利用酶标仪可以较快的检测粮食中的真菌毒素含量,可以提高工作效率。
关键词:酶标仪;真菌毒素;应用
中图分类号:Q939.5 文献标识码:A文章编号:1007-9599 (2010) 01-0000-02
粮食中的真菌毒素主要是黄曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲霉素、伏马毒素和展青霉素。真菌毒素是产毒真菌的代谢物,在适宜的温、湿度条件下,这些产毒真菌就会在着生的粮食上生长繁殖,产生真菌毒素;真菌毒素也可能因畜禽食用了含真菌毒素的粮食而进入其乳、蛋中从而再次带入食物链。由于真菌毒素会造成人畜的致癌、造成免疫系统、泌尿系统、血液系统、肾脏等急性和慢性中毒,因此,就必须要尽量避免人畜接触真菌毒素。
目前,许多国家依据公共卫生意义和商业目的,都制定了食品和饲料中真菌毒素的限量。因此需要灵敏、精确地对样品进行分析的仪器,以确保其含量低于规定的限量。下面以黄曲霉毒素的检测实验来说明酶标仪在粮食真菌毒素检测中的应用。
黄曲霉毒素(aflatoxin,简称为AF)是到目前为止所发现的毒性最大的真菌毒素。它可通过多种途径污染食品和饲料,直接或间接进入人类食物链,威胁人类健康和生命安全,对人体及动物内脏器官尤其是肝脏损害严重,该毒素是黄曲霉和寄生曲霉中产毒菌株的代谢产物,普遍存在于霉变的粮食及粮食制品中。黄曲霉毒素十分耐热,加热至230℃才能被完全破坏,因此一般烹饪加工也不易消除。
黄曲霉毒素是剧毒物质,其毒性相当于氰化钾的10倍,砒霜的68倍。黄曲霉毒素属肝脏毒,除抑制DNA、RNA的合成外,也抑制肝脏蛋白质的合成,黄曲霉毒索引起人类的急性中毒事件,国内外均有许多报导,最典型的是印度的霉变玉米事件,该事件直接导致了数十人丧生,数百人患上不同类型的肝脏疾病。
黄曲霉毒素有极强的致癌性,长期摄入黄曲霉毒素会诱发肝癌。它诱发肝癌的能力比二甲基亚硝胺大75倍,是目前公认的致癌性最强的物质之一。另据世界卫生组织报导,黄曲霉毒素含量在30~50ug/kg时为低毒,50~100ug/kg时为中毒,100~1000ug/kg时为高毒,1000ug/kg以上为极毒。鉴于黄曲霉毒素对人类的巨大危害性,我国对其在食品中的含量作了严格规定,其中,乳制品中黄曲霉毒素最高允许量为5ug/kg。
一、原理与方法
酶标仪:即酶联免疫检测仪(ELISA Reader)是酶联免疫吸附试验的专用仪器。可简单地分为半自动和全自动2大类,但其工作原理基本上都是一致的,其核心都是一个比色计,即用比色法来分析抗原或抗体的含量。ELISA测定一般要求测试液的最终体积在250l以下,用一般光电比色计无法完成测试,因此对酶标仪中的光电比色计有特殊要求。
ELISA实验原理:用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗体的微孔中依次加入标本或者标准品、生物素化的抗体、HRP-标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物显色。底物在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的目标蛋白呈正相关。用酶标仪在(450nm)波长下测定测定O.D.值(吸光度),计算样品浓度。
自2003年8月1日起,凡在我国境内从事米、面、油、酱油、醋生产加工的企业,其产品须经检验合格后方可上市。国家质检总局的《关于印发小麦粉等5类食品生产许可证实施细则的通知》中明确规定,黄曲霉毒素B1必须检测。在第八期《中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局公报》中关于黄曲霉毒素检测方法的最新国标:GB/T18979-2003《食品中黄曲霉毒素的测定免疫亲和层净化高效液相色谱法和荧光光度法》、GB/T18980-2003《乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的测定免疫亲和层净化高效液相色谱法和荧光光度法》以上两项国标均在2003年8月1日开始实施。粮食行业执行GB/T5009.22-2003《食品中黄曲霉毒素B1的测定》第二法。
(一)酶标仪测粮食中的黄曲霉毒素含量仪器、试剂
1.DNM-9602G型酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司);T1000电子天平(感量0.1g);50微升微量移液器及配套吸头;恒温培养箱(0℃-50℃);冰箱(4℃-8℃);玻璃器皿: 锥形瓶,烧杯,分液漏斗,蒸发皿,量筒,具塞试管,滴管,移液管;滤纸等。
2.黄曲霉毒素B1酶联免疫定量测试盒(无锡市艾赛生物技术有限责任公司);石油醚;甲醇;蒸馏水
(二)实验步骤
1.样品处理方法:称5.0g样品(已粉碎)于100ml具塞三角瓶中,准确加入25.0ml甲醇水(1+1)溶液,加塞振摇15min,弃去1/4初滤液,收集试样滤液,此液为样品提取液。假设样品不需稀释,此液则为待测样液。
2.试剂的配制。
(1)每瓶C试剂(酶标抗原)中准确加入1.5mlD试剂(酶标抗原稀释液),充分溶解,配成实验用酶标抗原溶液,2℃-8℃保存。
(2)取适量E试剂(浓缩洗涤液)用蒸馏水稀释20倍待用
3.操作流程:样品提取,适当稀释,试剂准备,加样,免疫反应37℃,30min显色反应37℃,15min,结果判定,仪器法,计算含量。
二、结 果
建立数学模型X(ng/g)=C×Vm ×D
式中:X:黄曲霉毒素B1含量(ng/g);
C:待测样液中黄曲霉毒素B1含量(ng/ml);
V:样品提取液体积(ml);m:样品质量(g);D:样品稀释倍数
三、记录
随着我国法律的不断完善,人们的法制观念不断增强,建立健全原始记录十分重要和必要。原始记录不仅是仪器打印出来的数据,还应记录试剂盒厂家、批号、效期、质控物来源、批号、有效期、检测者、复核者等相关内容,同时可用原始记录进行资料分析,更好地开展工作。但要注意的是原始记录不宜保存在电脑内,应打印后装订保存。
四、讨论
(一)在ELISA实验过程中,酶标板在温育时应加膜覆盖以避免液体蒸发;
(二)在ELISA实验过程中,检测液A和检测液B,以及底物溶液在使用前,应置于37℃温育30分钟待用;
(三)洗板要干净,避免交叉污染。
(四)在ELISA实验过程中,洗板后应尽快进行下一步操作,避免酶标板长时间处于干燥状态。
(五)严格按照试剂盒的说明书操作,反应时间准确。
(六)使用移液器加液,移液枪头不能混用。
(七)对于因试剂盒问题造成的测量结果的偏差,应根据实际情况及时修改参数,以达到最佳效果。
五、酶标仪维护保养
(一)注意仪器的工作环境应保持相对干燥,操作环境温度应在15℃~40℃之间,环境湿度在15%~85%之间;
(二)下班后应把交流电源关掉,(注意仪器上的开关只管仪器本身,变压器还在工作);
(三)防尘,保持机器表面清洁;
(四)仪器应放置在无强磁场和干扰电压的位置。仪器应放置在噪音低于40分贝的环境下应避免阳光直射。
六、酶联免疫技术与酶标仪的发展
由于样品检测过程中有时需要对仅有的少量样品进行检测,而且由于检测样本数量大,因而要求进行微量检测,从而能够达到节约样品、试剂的目的。进行微量检测对于仪器的灵敏度的要求大大提高,因此一些更加灵敏的检测方法和新技术就被运用到酶标仪中,从而提高丁仪器的灵敏度,克服了检测过程中样品、试剂有限的问题。根据不同需要研制的不同类型的酶标仪也不断涌现,如全自动荧光检测酶标仪、温控酶标仪等,这一类型仪器的发展,必将检测领域的工作起到巨大的推动作用。