1HNMR代谢组学技术用于牛黄解毒片中对雄黄ぞ哂信湮榧醵咀饔玫闹饕化学成分群的研究
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[摘要] 利用1hnmr为基础的代谢组学技术，探讨牛黄解毒片中对雄黄具有配伍减毒作用的主要化学成分群。将24只大鼠随机分成4组：空白组、R组（雄黄组）、RRSPG组（雄黄配伍大黄、黄芩、桔梗和甘草组）、RC组（雄黄配伍大黄总蒽醌、黄芩总黄酮、桔梗总皂苷、甘草总黄酮和甘草总皂苷组），对各组大鼠尿液及血清样品1HNMR谱图进行模式识别分析。结果显示雄黄组大鼠尿液及血清样品代谢轮廓和空白组差异明显，RC组大鼠代谢轮廓同空白组相似，向空白组回归，RC组各化学成分可通过调节能量代谢、胆碱代谢、氨基酸代谢和肠道微生物代谢等方面而起到降低雄黄毒性的作用。
[关键词] 代谢组学； 牛黄解毒片； 雄黄； 化学成分群； 配伍减毒
1HNMRbased metabonomics on chemical component groups with toxicity
alleviation effect to Realgar in Niuhuang Jiedu tablet
XU Wenfeng1， PEI Yuehu2*
（1 Department of Pharmacy， Beijing Hospital， Beijing 100730， China；
2 Key Laboratory of TargetBased Drug Design and Research Under Ministry
of Education， Shenyang Pharmaceutical University， Shenyang 110016， China）
[Abstract] To study the chemical component groups with toxicity alleviation effect to Realgar in Niuhuang Jiedu tablet based on1HNMR metabonomics Twentyfour male Wistar rats were divided into four groups： control group， R group （treated with Realgar）， RRSPG group （treated with Realgar， the root and rhizoma of Rheum palmatum， the root of Scutellaria baicalensis， the root of Platycodon grandiflorum and the root and rhizoma of Glycyrrhiza uralensis） and RC group （treated with total anthraquinones from the root and rhizoma of R. palmatum， total flavonoids from the root of S. baicalensis， total saponins from the root of P. grandiflorum， total flavonoids and saponins from the root and rhizoma of G. uralensis） Based on1HNMR spectra of urine and serum from rats， PLSDA was performed to identify different metabolic profilesThe metabolic profiles of R group were different from that of control group， while the metabolic profiles of RC group were almost similar to control groupTotal anthraquinones from the root and rhizoma of R. palmatum， total flavonoids from the root of S. baicalensis， total saponins from the root of P. grandiflorum， total flavonoids and saponins from the root and rhizoma of G. uralensis regulated energy， choline and amino acid metabolism and gut flora disorder affected by realgar′s toxicity
[Keywords] metabonomics； Niuhuang Jiedu tablet； Realgar； chemical component group； toxicity attenuation
doi：10.4268/cjcmm20161210
牛黄解毒片是清热解毒名方，始见于元代《咽喉脉证通论》一书，被2015年版《中国药典》一部收载。牛黄解毒片由人工牛黄、雄黄、冰片、石膏、大黄、黄芩、桔梗和甘草组成，用于治疗火热内盛，咽喉肿痛，牙龈肿痛，口舌生疮，目赤肿痛等。砷是国际癌症中心确认的人类致癌物之一，可引起皮肤癌、肺癌、膀胱癌和肾癌[1]。牛黄解毒片每日服用量中雄黄的含量高达200～300 mg，相当于药典规定的雄黄最高服用量的2～3倍。作为含砷复方牛黄解毒片的安全性问题已引起国内外药品监管部门的关注[2]。
近年来，国内外开始利用代谢组学技术进行早期的药物毒性研究。主要利用HPLCMS，NMR等测定生物体体液中内源性代谢产物含量，研究生物体系代谢途径，从而反映出中毒或代谢损害而引起的细胞功能异常。前期研究结果表明，牛黄解毒片几乎不呈现雄黄样肝肾毒性；牛黄解毒片组方配伍后，大黄、黄芩、桔梗和甘草共同起到了降低雄黄肝肾毒性的作用。本实验继续采用基于1HNMR代谢组学技术研究大黄、黄芩、桔梗和甘草中的主要成分大黄总蒽醌、黄芩总黄酮、桔梗总皂苷、甘草总黄酮和甘草总皂苷与雄黄配伍后雄黄的毒性，进一步阐释牛黄解毒片中可能对雄黄具有配伍减毒作用的主要化学成分群。
1 材料
2， 2， 3， 3三甲基硅烷基丙酸[3（trimethylsilyl）propionic2， 2， 3， 3d4 acid sodium salt， TSP]，重水（deuterium oxide， D2O）购自青岛腾龙微波科技有限公司。Bruker AVANCE600型核磁共振波谱仪（瑞士Bruker公司）。
雄黄（批号201002）、大黄（批号201005）、黄芩（批号200911）、桔梗（批号200912）、甘草（批号201005）均购于河北省安国市昌达中药饮片公司（生产许可证冀Y20050130）。由沈阳药科大学生药学教研室路金才教授对实验中药予以鉴定，均符合2010年版《中国药典》标准。其中大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum的干燥根和根茎，黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis的干燥根，桔梗为桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorum的干燥根，甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis的干燥根和根茎。
SPF级雄性Wistar大鼠24只，体重（170±20） g，由沈阳药科大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK（军）20090004。动物自由摄食饮水，饲养室光照12 h，黑暗12 h，室温17～25 ℃，湿度45%～60%。
2 方法
21 试药的配制 经计算需要大黄4032 g、黄芩3024 g、桔梗2016 g、甘草1008 g。参照文献制定大黄总蒽醌[34]、黄芩总黄酮[56]、桔梗总皂苷[78]、甘草总黄酮[910]和甘草总皂苷[11]的制备方法。共分离得到大黄总蒽醌830 g、黄芩总黄酮1110 g、桔梗总皂苷827 g、甘草总黄酮314 g、甘草总皂苷534 g。
22 动物分组及给药方法 将大鼠于代谢笼中饲养适应7 d，按照体重随机分成4组（空白组；R组： 雄黄组；RRSPG组： 雄黄配伍大黄、黄芩、桔梗和甘草组；RC组： 雄黄配伍大黄总蒽醌、黄芩总黄酮、桔梗总皂苷、甘草总黄酮和甘草总皂苷组），每组6只。大鼠的分组情况及给药剂量见表1，雄黄的剂量是参照文献[12]及预实验设定的，其他中药的剂量是按照2010年版《中国药典》中牛黄解毒片各味中药的配比设定的。每天上午固定时间灌胃给药，连续给药7 d。灌胃容量为20 mg・kg-1。
23 生物样品的采集 采用代谢笼法，从给药前1 d开始分别收集每天夜间12 h尿液直到实验结束。收集尿液的试管需放置于装有冰块的烧杯中，并在试管中加入100 μL NaN3作为抑菌剂。将收集好的尿液转移至EP管中，于-20 ℃条件下保存待用。采用腹腔动脉取血方式采集血液样品，离心（15 000×g，10 min），将上清液即血清样品转移至EP管中，于-80 ℃条件下保存待用。
24 尿液和血清样品的制备与测试 尿液样品的制备与测试：取出尿液样品，常温解冻，离心（3 500×g， 5 min， 4 ℃），取上清液400 μL与200 μL磷酸盐缓冲液（02 mol・L-1， pH 74）混匀，静置5 min，离心（3 500×g， 5 min， 4 ℃），取上清液500 μL加入40 μL TSP和20 μL D2O，混匀，转移至5 mm核磁样品管中。尿液样品采用有水峰压制的1D NOESY脉冲程序，测试参数如下：谱宽12 0192 Hz，弛豫延迟时间3 s，混合时间01 s，测试时间273 s，采样数据点64 K，累加次数64次，在弛豫延迟时间内采用预饱和方式压制水峰，水峰压制脉冲强度为50 dB。
血清样品的制备与测试：取出血清样品，常温解冻，离心（15 000×g，10 min，4 ℃），取上清液300 μL加入100 μL TSP和200 μL D2O，混匀，转移至5 mm核磁样品管中进行测试。血清样品采用有水峰压制的1D CPMG （CarrPurcellMeiboomGill）脉冲程序，测试参数如下：谱宽12 0192 Hz，弛豫延迟时间3 s，混合时间01 s，测试时间273 s，采样数据点64 K，累加次数64次，在弛豫延迟时间内采用预饱和方式压制水峰，水峰压制脉冲强度为50 dB。
25 数据的处理与分析 采用MestReNova软件（MestReNova 61， Mestrelab Research SL）将FID（free induction decay， 自由感应衰减）信号通过傅立叶变换成一维NMR谱图，进行相位和基线校正，以TSP峰为化学位移参考峰，化学位移标记为δ 0，将δ 96～02的谱图以004为宽度进行分段积分，并将产生的积分面积数据以Excel文件格式保存，其中尿液样品谱图中δ 620～548（尿素峰），δ 520～472（水峰），血清样品谱图中δ 520～460（水峰）需要删除，将柠檬酸的信号δ 270～264， 258～252合并为δ 266，254，然后将所有数据进行归一化和标准化处理（SPSS 115， Chicago， Inc， USA），用于模式识别分析。
最后将上述数据导入SIMCAP 115软件包（Umetrics AB， Umea， Sweden）进行偏最小二乘判别分析（PLSDA），分析结果以得分图（scores plot）和载荷图（loadings plot）的形式表示。
3 结果
各组大鼠尿液样本的600 MHz1HNMR代表性谱图见图1。R，RRSPG，RC，空白组的PLSDA得分图见图2，证实RRSPG，RC组的尿液代谢轮廓与空白组相似，区别于R组。相应的载荷图显示RRSPG组与RC组尿液中亮氨酸，异亮氨酸，3羟基丁酸盐等内源性物质的浓度相比R组发生了变化。各组大鼠尿样中内源性代谢产物的变化趋势见表2。
各组大鼠血清样本的600 MHz1HNMR代表性谱图见图3。R，RRSPG，RC组与空白组的PLSDA得分图证实RRSPG与RC组的血清代谢轮廓向空白组回归，与空白组相似，区别于R组。相应的载荷图显示RRSPG组与RC组血清中亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸等内源性代谢产物的浓度相比R组发生了变化。各组大鼠血清中内源性代谢产物的变化趋势见表3。
A空白组；B雄黄组；C雄黄配伍大黄、黄芩、桔梗、甘草组；D雄黄配伍大黄总蒽醌、黄芩总黄酮、桔梗总皂苷、甘草总黄酮和甘草总皂苷组；1低密度/极低密度脂蛋白CH3；2亮氨酸，异亮氨酸；3缬氨酸；4低密度/极低密度脂蛋白CH2；5乳酸盐；6丙氨酸；7乙酸盐；8N乙酰糖蛋白；9甲硫氨酸；10乙酰乙酸盐；11丙酮酸盐；122酮戊二酸盐；13柠檬酸盐；14肌酸；15胆碱；16N氧化三甲胺；17葡萄糖；18α葡萄糖；19不饱和脂类。
4 讨论
41 能量代谢 三羧酸循环是能够将乙酰辅酶A中的乙酰基氧化成二氧化碳和还原当量的酶促反应循环系统[14]，是三大营养物质（糖类、脂类和氨基酸）的最终代谢通路，又是糖类、脂类和氨基酸联系的枢纽。柠檬酸盐和2酮戊二酸盐是三羧酸循环的重要中间产物。肝细胞线粒体是三羧酸循环的主要场所。柠檬酸盐与2酮戊二酸盐含量的变化与肝脏能量代谢有关，可反映肝脏线粒体的功能，其含量降低通常是由于线粒体功能紊乱引起的[15]。雄黄引起上述代谢产物的代谢紊乱，说明雄黄能够影响肝细胞线粒体酶的活性，进而造成肝组织能量代谢紊乱。当线粒体功能减弱，三羧酸循环和氧化磷酸化的效率降低，肝细胞通过增强糖酵解糖异生途径来弥补ATP生成的不足[16]。丙酮酸是糖酵解糖异生过程的重要中间产物，所以R组大鼠体内丙酮酸含量明显高于空白组大鼠。当三羧酸循环受到抑制，糖酵解糖异生作用强于氧化磷酸化水平，丙酮酸氧化脱羧作用降低，生成乳酸的过程增强[17]，这一现象也见于其他造成肝损伤物质的研究中[18]。糖酵解糖异生功能增强会转而抑制乙酰辅酶A进入三羧酸循环[19]，乙酰辅酶A会被转化成酮体[20]。解释了R组大鼠尿液当中酮体之一3羟基丁酸盐含量较空白组大鼠高这一结果。R组大鼠体内乙酸盐含量增加也是由于线粒体功能降低造成的。乙酰辅酶A会在乙酰辅酶A水解酶的作用下生成乙酸盐[21]。此外乙酸盐含量增加还是肾损伤的标志之一[22]。
42 氨基酸代谢 R组尿液中氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸）的浓度升高，意味着肾小管对低分子化合物重吸收的能力下降，是一个典型的近曲小管非特异性损伤标志[23]。肝脏是体内氨基酸代谢的主要场所，当肝脏产生损伤时，肝细胞中氨基酸代谢紊乱，可造成血清中支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）浓度的降低[24]。以上2种因素造成R组与空白组相比尿液和血清中氨基酸含量的变化。
尿液中牛磺酸和肌酸的变化与肝脏毒性有着密切的关系[26]，其含量升高通常意味着肝脏损伤[27]。肌酸酐是肌酸的代谢产物，含量基本恒定，大部分从肾小球滤过而不被肾小管吸收，其变化主要反映肾小球的滤过功能（肾脏的排泄能力）[28]。实验中，R组大鼠血清中肌酸酐含量较空白组升高，说明肌酸酐的清除率在R组大鼠肾脏中降低，即雄黄会影响肾小球的滤过功能。
43 胆碱及肠道微生物代谢 胆碱是细胞膜的组成成分，在维持细胞膜的完整性以及脂类代谢中发挥着至关重要的作用。有研究表明雄黄能够破坏细胞膜的结构，改变细胞膜的渗透性[25]。R组大鼠尿液中胆碱含量升高很有可能是雄黄的细胞膜毒性造成的。
TMAO是胆碱的降解产物，首先胆碱需要在肠道菌群的作用下转化成TMAO的前体物三甲胺，然后三甲胺在肝脏中被黄素单加氧酶系统氧化为TMAO。雄黄作为一种矿物药对肠道菌群会产生影响[29]，R组大鼠体内TMAO含量下降很有可能是雄黄改变肠道微生物环境造成的。甜菜碱也是胆碱的代谢产物。当肠道微生物活性降低，TMAO生成减少，尿液中甜菜碱的含量会增加[30]，与实验结果R组大鼠尿液中甜菜碱含量升高相吻合。此外，肾小管损伤也会造成尿液当中甜菜碱含量的增加[31]。马尿酸盐的生成需要有充足的ATP[32]，由于线粒体中氧化磷酸化过程活性降低，ATP生成不足，会影响马尿酸盐的生成。其次，马尿酸盐的前体苯甲酸是肠道菌群的产物[33]，肠道菌群活性降低，苯甲酸的生成量会受到影响，进而影响马尿酸盐的生成。R组大鼠尿液中马尿酸盐含量下降进一步证实雄黄对大鼠肝脏造成的损伤以及对肠道菌群活性的影响。
大鼠经口给药雄黄后，内源性代谢产物变化见图4。
综上，大黄总蒽醌、黄芩总黄酮、桔梗总皂苷、甘草总黄酮和甘草总皂苷通过调节大鼠体内能量代谢、胆碱代谢、氨基酸代谢和肠道微生物代谢等方面而起到降低雄黄毒性的作用。
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