嗜水气单胞菌asd―1基因功能研究

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇嗜水气单胞菌asd―1基因功能研究范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

摘要：asd-1基因编码天冬氨酸半醛脱氢酶，该酶可影响革兰氏阴性菌的细胞壁正常合成。为了研究嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）asd-1基因的功能，采用Overlap PCR方法敲除该基因，结果显示asd-1基因的敲除明显降低了嗜水气单胞菌的生长速度，但是不会导致突变株对二氨基庚二酸（DAP）的强制需求，进一步对氨基酸序列分析表明asd-1蛋白质较迟缓爱德华氏菌、鲶爱德华氏菌的asdA蛋白质多出3个氨基酸，其中Asn-257导致asdA蛋白质中的关键活性位点Arg-267在asd-1蛋白质中改变为Val-267，该研究表明嗜水气单胞菌的asd-1基因突变显著降低其生长速度。

关键词：嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）；asd-1基因；生长速度；二氨基庚二酸（DAP）

中图分类号：S941 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）10-2667-04

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.10.054

Abstract：Aspartate β-semialdehyde deshydrogenase which participated in the cell wall synthesis was edcoded by asd-1 gene. In order to revealing the function of Aeromonas hydrophila asd-1 gene， this study deleted it by overlap PCR technology. The result showed that the bacteria growth rate decreased significantly when asd-1 gene deleted， but the obligate requirement for diaminopimelic acid（DAP） in asd-1 mutants was not changed. Amino acid sequencs alignment further showed that asd-1 protein had 370 amino acids， but the asdA protein of Edwardsiella tada and Edwardsiella ictalari just had 367 amino acids. The Asn-257 resulted the key site Arg-267 in asdA protein changed to Val-267 in asd-1 protein. It indicated that asd-1 gene mutant decreased the growth rate of Aeromonas hydrophila significantly.

Key words： Aeromonas hydrophila； asd-1 gene； growth rate； diaminopimelic acid（DAP）

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是一种在水样环境中广泛存在的细菌，该菌极易接触动物，如鱼、青蛙和人类等，到目前为止已经从鱼、食物、环境及临床样品中分离出该菌并且认为该菌是鱼、爬虫动物及人类的一种重要的病原菌，该病原常引起疖疮病、溃疡性结肠炎和细菌性败血症等疾病，具有发病鱼种类多，流行范围广，多呈急性流行，发病后死亡率高的特点，在渔业养殖中由嗜水气单胞菌引起的鱼类死亡每年给全球带来巨大的经济损失，同时嗜水气单胞菌也是许多鱼类疾病的共感菌[1-4]。

asd-1基因编码天冬氨酸半醛脱氢酶（Asd；EC1.2.1.11），该酶是一种高度保守的同源二聚体酶，可将β-天冬氨酰磷酸转换为β-半醛天冬氨酸盐。同时天冬氨酸半醛脱氢酶也是赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸等关键氨基酸生物合成的必需蛋白，同时它还在合成二氨基庚二酸（DAP）的反应中起关键作用，而DAP是革兰氏阴性菌及部分革兰氏阳性菌细胞壁成分肽聚糖的必需物质[5-7]。天冬氨酸半醛脱氢酶功能的缺失将导致细菌对DAP的强制性需求，否则细菌将裂解，在迟缓爱德华氏菌、鲶爱德华氏菌、嗜肺军团菌中已经得到证实[8-10]，但在嗜水气单胞菌的研究中尚未见相关报道。为了揭示asd-1基因在嗜水气单胞菌中的功能，本研究通过Overlap PCR技术敲除asd-1基因以探讨该基因的功能。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用嗜水气单胞菌AH-1菌株来自中国科学院水生生物研究所聂品实验室，其他所用菌株及质粒为武汉市农业科学技术研究院水产科学研究所鱼病室保存，详见表1。

试验所用酶制剂来自TaKaRa公司，基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒购于天根生化科技有限公司，试验所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

PCR产物纯化及DNA测序：采用PCR产物回收试剂盒（金斯瑞生物科技有限公司）纯化回收目的DN段，送金斯瑞生物科技有限公司测序，利用Blast程序进行序列比对。

1.2 嗜水气单胞菌AH-1菌株asd-1基因的克隆

参照嗜水气单胞菌ATCC 7966菌株的asd-1基因（NC_008570）序列设计引物asd1-checkF与asd1-checkR，详见表2。以嗜水气单胞菌AH-1菌株基因组为模板扩增asd-1基因序列，将PCR产物连接到pMD18-T载体上送至金斯瑞生物科技有限公司测序。

1.3 嗜水气单胞菌AH-1菌株asd-1基因缺失突变株的构建

通过等位基因交换的方式构建非极性突变[11]，正如之前所描述的那样[12]，可概括为参照嗜水气单胞菌ATCC 7966菌株的asd-1基因（NC_008570）上下游序列设计引物对asd1-for、asd1-int-rev和asd1-int-for、asd1-rev，详见表2。以嗜水气单胞菌AH-1菌株基因组为模板分别扩增asd-1基因上下游序列。以获得的上下游片段混合物为模板，以asd1-for、asd1-rev为引物通过Overlap方法获得缺失了asd-1基因的片段，将所获得的片段连接入质粒pRE112获得pRE112-asd1转化大肠杆菌MC1061 λ pir，将pRE112-asd1转入S17-1 λ pir用于与嗜水气单胞菌进行结合转移。突变株通过含有10%蔗糖的TSA培养基筛选。

1.4 嗜水气单胞菌AH-1菌株asd-1基因突变株的性状分析

突变菌株asd1和野生菌株在TSB培养基中28 ℃培养过夜，连续10倍稀释，转接使终浓度大约为106 CFU/mL，28 ℃ 200 r/min培养，每隔1 h取样测定OD540 nm，绘制生长曲线。

1.5 数据分析

采用GraphPad prism软件对试验数据进行处理，采用Two-way ANOVA检测数据组之间的差异。

2 结果与分析

2.1 嗜水气单胞菌AH-1菌株asd-1基因的克隆及分析

测序获得一段长度为1 498 bp DNA序列，该序列包含了长度为1 116 bp的asd-1基因，该基因序列已经提交至NCBI，GenBank序列号为KR028357。bl2seq分析表明KR028357与NC_008570之间一致性为98%（图1A）。将KR028357与NC_008570翻译成蛋白质比较发现两者之间仅有一个氨基酸的差异，即第181个氨基酸在菌株ATCC 7966中为亮氨酸（L），而在菌株AH-1中为蛋氨酸（M）（图1B）。将KR028357翻译成蛋白质与迟缓爱德华氏菌、鲶爱德华氏菌的asdA蛋白质序列比对发现，嗜水气单胞菌的asd1蛋白质序列较asdA蛋白质序列多出3个氨基酸，其中Asn-257导致在迟缓爱德华氏菌、鲶爱德华氏菌中的关键活性位点Arg-267在嗜水气单胞菌的氨基酸改变为Val-267，详见图2。

2.2 嗜水气单胞菌AH-1菌株asd-1基因缺失突变株的构建

引物asd1-for、asd-int-rev扩增得到一段位于asd-1基因上游长度为417 bp的序列（图3A），引物asd-int-for、asd1-rev扩增得到一段位于asd-1基因下游长度为652 bp的序列（图3B）。以获得的上下游片段混合物为模板，以asd1-for、asd1-rev为引物通过Overlap方法获得缺失了asd-1基因的长度为1 069 bp的片段（图3C）。在经过2轮同源双交换之后获得了氯霉素敏感蔗糖耐受的突变株asd1（图3D）。

2.3 嗜水气单胞菌突变株asd1生长特性分析

生长曲线（图4）表明，突变株asd1的生长速度明显慢于野生型菌株，Two-way ANOVA检测数据组之间的差异为P

3 小结与讨论

天冬氨酸半醛脱氢酶是细胞壁合成反应中重要的一种蛋白质，该蛋白质功能的缺失将导致细胞壁合成障碍，在迟缓爱德华氏菌和鲶爱德华氏菌已经得到证明[8，9]，本试验克隆了嗜水气单胞菌AH-1菌株的asd-1基因，该基因与公布的标准菌株ATCC 7966菌株asd-1基因在氨基酸序列上仅在第181位点存在差异，且该位点并非关键活性位点，因此从功能上推测该基因在嗜水气单胞菌不同菌株间不存在差异。通过Overlap PCR敲除了asd-1基因，在敲除该asd-1基因之后发现虽然在生长速度上缺失突变株与野生型存在明显差异，但是并未出现突变株对DAP底物强制需求的现象，迟缓爱德华氏菌和鲶爱德华氏菌的asdA基因功能研究表明其关键活性位点为Cys-135、Gln-162、Arg-267，通过与迟缓爱德华氏菌、鲶爱德华氏菌asdA氨基酸序列的比对发现，asd-1的氨基酸序列较迟缓爱德华氏菌、鲶爱德华氏菌asdA氨基酸序列多出3个氨基酸，其中多出的Asn-257导致关键活性位点Arg-267变成了Val-267，可能正是在关键酶活位点上的改变及Asn-257的存在导致了该蛋白质功能的变化。本研究表明嗜水气单胞菌的asd-1基因并不直接影响细胞壁的合成，必然还有另外的基因和信号通路影响细胞壁的合成。

参考文献：

[1] LIU D. Chapter 61-Aeromonas in Molecular Medical Microbiology （Second Edition） （Schwartzman，Y.-W. T. S. L. P.，ed）[M].Boston：Academic Press，2015.1099-1110.

[2] SINGH V，CHAUDHARY D K，MANI I，et al. Development of diagnostic and vaccine markers through cloning， expression， and regulation of putative virulence-protein-encoding genes of Aeromonas hydrophila[J]. Journal of Microbiology，2013，51（3）：275-282.

[3] NIELSEN M E，HOI L，SCHMIDT A S，et al. Is Aeromonas hydrophila the dominant motile Aeromonas species that causes disease outbreaks in aquaculture production in the Zhejiang Province of China[J]. Diseases of Aquatic Organisms，2001， 46（1）：23-29.

[4] 沈锦玉.嗜水气单胞菌的研究进展[J].浙江海洋学院学报（自然科学版），2008，27（1）：78-86.

[5] VIOLA R E.The central enzymes of the aspartate family of amino acid biosynthesis[J]. Accounts of Chemical Research，2001，34（5）：339-349.

[6] PAIDHUNGAT M，SETLOW B，DRIKS A，et al.Characterization of spores of Bacillus subtilis which lack dipicolinic acid[J].Journal of Bacteriology，2000，182（19）：5505-5512.

[7] PAVELKA M S JR，JACOBS W R JR.Biosynthesis of diaminopimelate，the precursor of lysine and a component of peptidoglycan，is an essential function of Mycobacterium smegmatis[J].Journal of Bacteriology，1996，178（22）：6496-6507.

[8] YAN Y， MU W， ZHANG L，et al. Asd-based balanced-lethal system in attenuated Edwardsiella tarda to express a heterologous antigen for a multivalent bacterial vaccine[J]. Fish & Shellfish Immunology，2013，34（5）：1188-1194.

[9] SANTANDER J， XIN W， YANG Z，et al. The aspartate-semialdehyde dehydrogenase of Edwardsiella ictaluri and its use as balanced-lethal system in fish vaccinology[J]. PloS One，2010， 5（12）：e15944.

[10] HARB O S， KWAIK Y A. Identification of the aspartate-β-semialdehyde dehydrogenase gene of Legionella pneumophila and characterization of a null mutant[J].Infection and Immunity，1998，66（5）：1898-1903.

[11] EDWARDS R A，KELLER L H，SCHIFFERLI D M. Improved allelic exchange vectors and their use to analyze 987P fimbria gene expression[J].Gene，1998，207（2）：149-157.

[12] ZHENG J，TUNG S L，LEUNG K Y. Regulation of a type III and a putative secretion system in Edwardsiella tarda by EsrC is under the control of a two-component system，EsrA-EsrB[J].Infection and Immunity，2005，73（7）：4127-4137.