δ阿片受体激动剂对脓毒症大鼠肝线粒体呼吸功能的保护作用
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[摘要] 目的 探讨δ阿片受体激动剂DADLE（D-Ala2-D-Leu5-enkephalin）对脓毒症大鼠肝线粒体呼吸功能的保护作用。 方法 将60只健康雄性SD大鼠随机分为脓毒症组（SEP组，n=20）、假手术组（SO组，n=20）和DADLE组（n=20）。采用改良盲肠结扎穿孔方法建立脓毒症大鼠模型，假手术组除不结扎刺穿盲肠，DADLE组建立模型后按5 mL/kg剂量腹腔注射浓度为0.5 mg/mL的DALDE。制模8 h后处死大鼠， 取血清检测ALT和AST水平，取肝组织测定肝细胞线粒体呼吸功能及肝组织ATP、ADP、AMP含量。 结果 DADLE组大鼠呼吸控制率（RCR）、磷/氧化（ADP/O）与SEP组比较显著升高（P
[关键词] δ阿片受体激动剂；脓毒症；盲肠结扎穿孔；线粒体
[中图分类号] R96 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）16-0008-03
[Abstract] Objective To study the protective effect of δ opioid receptor agonist DADLE（D-Ala2-D-Leu5-enkephalin） on mitochondrial respiratory function in a rat model of sepsis. Methods Sixty SD rats were randomly divided in to sham operated group （SO）， septic group （SEP）， and DADLE group （DADLE）， each of 20 cases. Sepsis model was produced by cecal ligation and puncture （CLP）. In SO group，the abdomen was opened without any other treatment. In DADLE group， DADLE （0.5 mg/mL） was administer at a dose of 5 mL/kg by intra-peritoneal injection after CLP. All rats were sacrificed 8 hours after CLP. ALT and AST in blood were determined. Mitochondrial respiratory function was evaluated by the clark oxygen eletrode. The levels of ATP， ADP， AMP were determined by high performance liquid chromatography （HPLC）. Results RCR and ADP/O in DADLE group were much higher than that in SEP group （P
[Key words] DADLE； Sepsis； CLP； Mitochondria
在脓毒症（sepsis）发展过程中肝脏是易受累的重要器官，因为脓毒症早期便可出现线粒体结构和功能的破坏，而线粒体在肝细胞物质代谢、信息转导和细胞凋亡等方面起着至关重要的作用，因此肝脏线粒体的损伤常常导致肝细胞能量代谢障碍及内环境紊乱， 最终介导肝细胞死亡[1-3]。脓毒症早期肝细胞大量坏死，肝功能损害发展为肝功能衰竭往往是脓毒症引起多器官功能衰竭（MODS）的开始和重要标志[4，5]。2013年6～10月我们以非选择性阿片受体激动剂DADLE处理脓毒症大鼠，并观察其对肝细胞线粒体呼吸功能的保护作用。
1 材料与方法
1.1分组及脓毒大鼠症模型制备
健康清洁级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（7～8周龄，体重：270～320 g） 60只由斯莱克（SLAC，上海）实验动物有限责任公司提供，随机分为脓毒症组（SEP组，n=20）、假手术组（SO组，n=20）和DADLE组（n=20）。
脓毒症大鼠模型制备：剖腹后找到盲肠，结扎盲肠远端，对传统的盲肠结扎穿孔（CLP） 方法进行改良：结扎盲肠远端后用12号针头穿刺近端盲肠造成穿孔，将盲肠穿孔数由2个增至4个[6]，而SO组仅行剖腹但不结扎刺穿盲肠，其余操作同脓毒症组。DADLE组在脓毒症模型建立后立即按5 mL/kg的剂量腹腔注射DADLE溶液（浓度：0.5 mg/mL）进行处理。各组制模后给予常规抗休克补液处理，制模后8 h将大鼠以颈椎脱臼法处死，取血及肝脏组织进行相关检测。
1.2 肝脏线粒体制备
秤取10 g大鼠肝脏组织，迅速置于0℃分离液（含EDTA 1 mmol/L，蔗糖0.25 mol/L、Tris-HCl 5 mmol/L，pH7.4）， 间断超声匀浆3 min，将制备好的组织匀浆以2×103 r/min离心8 min，留取上清液，以1×104 r/min离心15 min，弃去上清液，以分离液将沉淀重悬浮，再次以1×104 r/min离心15 min，再次弃去上清液，最后以2 mL分离液吹打重悬浮所得沉淀，即线粒体悬液。所得线粒体悬液内蛋白浓度以双缩脲法测定，再用分离液调整到合适浓度备用。
1.3 大鼠肝脏线粒体呼吸耗氧功能的测定
RCR=ADP启动（加入ADP 时）的态3呼吸速率/线粒体琥珀酸启动（ADP 耗竭后）的态4呼吸速率。态3呼吸速率和态4呼吸速率采用Clark氧电极技术测定。反应体系总体积3 mL，pH 7.35～7.45，包含：KCl 0.01 mol/L、MgCl2 5 mmol/L、琥珀酸0.2 mol/L、Tris-HCl 0.01 mol/L、蔗糖0.25 mmol/L、KH2PO4 5 mmol/L、ADP 加入浓度为0.33 mmol/L，线粒体蛋白浓度为1 g/L，计算呼吸控制率（respiratory control ratio，RCR）、磷/氧化（ADP/O）。
1.4 血清AST、ALT测定
采用美国贝克曼奥林巴斯AU680全自动生化分析仪检测大鼠血清AST、ALT水平，所需试剂由该公司提供。
1.5 大鼠肝脏组织AMP、ADP、ATP含量测定
称取30 mg大鼠肝脏组织放入0.5 mL冷却的10% HClO4中，在冰浴下间断超声匀浆3 min，并迅速制成20% 的匀浆液。将制备的肝脏组织匀浆液在4℃下以8×103 r/min离心min，留取上清液，置4℃ 冰箱保存待检。
高效液相色谱仪（HPLC）系统购自美国Waters 公司，包括： 486型高效液相色谱仪，510型自动进样泵和Millenium数据处理软件系统。色谱条件预柱为Nova-pak C18（3.9×150 mm，3.5 μm），流动相为NH4H2PO4缓冲液（浓度为0.1 mol/L，pH值为5.3），流速为0.9 mL/min，进样量为20 μL，紫外线检测波长为254 nm，灵敏度为0.01 AUFS，柱温为室温。
将AMP、ADP及ATP标准品（购自美国Sigma公司）分别配制成浓度梯度为0.0100 mmol/L、0.0200 mmol/L、0.0625 mmol/L和0.1250 mmol/L的标准液，取20 μL标准液进样，计算并绘制出标准曲线。将检测样品获得的AMP、ADP及ATP峰面积与标准品峰面积相比，计算大鼠肝脏组织ATP、ADP及AMP的含量[μmol/（g・wet）]。
1.6 统计学处理
采用SPSS 17.0统计学软件处理。计量资料用（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用q检验。P
2 结果
2.1 各组大鼠肝脏组织AMP、ADP、ATP含量和血清ALT、AST水平的变化
与SO组比较，SEP组和DADLE组ATP含量均明显降低（P
2.2 各组大鼠肝脏线粒体呼吸功能的变化
与SO组比较，SEP组、DADLE组的RCR和ADP/O均明显降低（P
3 讨论
虽然当前针对脓毒症的研究已取得了很大进展[7]，但其发展过程中多器官功能障碍综合征（MODS）的机制仍不明确。脓毒症的一个主要特征是细胞病理性缺氧及氧利用障碍，导致线粒体氧化磷酸化障碍、能量产生下降[8]。脓毒症时由于炎症因子大量释放、氧自由基水平升高和钙超载导致早期即可出现肝脏氧供需失衡、肝细胞能量代谢和内环境紊乱[9-11]，而导致急性肝损害甚至肝功能衰竭。本实验中我们发现，CLP制模后8 h血清ALT、AST水平明显升高，表明肝脏在脓毒症早期就已经受到累及，且反应剧烈，炎症造成大量肝细胞死亡，从而导致不同程度的肝损伤。本研究中我们发现经过DADLE处理，DADLE组大鼠血清ALT和AST水平明显低于脓毒症组，说明DADLE能明显减轻脓毒症对大鼠肝脏的损害，改善肝功能。
线粒体是一个细胞器，它是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，最基本的功能是通过氧化磷酸化过程将ADP、AMP转换为ATP，而且线粒体在细胞内信号转导和细胞凋亡等方面也起着至关重要的作用。线粒体损伤一般都表现为线粒体形态肿胀、内、外膜完整性破坏、嵴紊乱，形态学定量分析发现嵴的膜表面密度和膜间空隙明显增加，基质密度降低。另外，线粒体内膜和外膜受损机制不尽相同，内膜受损可能与线粒体MPTP开放有关，而外膜受损可能与线粒体通透转换无关，初步证据显示Bax可能参与外膜损害[12]。因此在严重创伤、感染等病理情况下，一旦线粒体膜结构和功能受到破坏[13]，可引起细胞能量代谢和细胞内环境紊乱，甚至引起细胞死亡，因此以线粒体为靶向的治疗逐渐受到关注。
RCR 与ADP/O比值一起，是用来衡量线粒体结构功能完整与否及氧化磷酸化偶联程度的灵敏指标。RCR值为ADP启动的态3呼吸速率与琥珀酸启动的态4呼吸速率的比值； ADP/O值是指线粒体每吸收一克原子氧的同时，生成ATP 的克分子数的比值，它反映线粒体的能量转化效率。ADP/O降低代表氧化磷酸化能量生成脱耦连，合成ATP 的能力下降。本研究通过检测RCR（呼吸控制率）和ADP/O来反映线粒体的呼吸功能及合成ATP的能力。本研究发现，脓毒症时肝脏ATP含量下降，RCR和ADP/O均明显降低，提示线粒体功能受损，肝脏能量代谢紊乱。DADLE是一种非选择性δ阿片受体激动剂，我们以往的研究已经证明其能明显改善脓毒症大鼠的存活率[14，15]，在本研究中DADLE处理组肝ATP含量较SEP组明显升高，同时RCR和ADP/O也有明显提高，这表明DADLE对脓毒症大鼠肝脏线粒体呼吸功能具有保护作用，从而改善了肝细胞在脓毒症缺氧状态下的能量代谢。
[参考文献]
[1] Crouser ED. Mitochondrial dysfunction in septic shock and multiple organ dysfunction syndrome[J]. Mitochondrion，2004， 4（5-6）：729-741.
[2] 龚平，李春盛. 脓毒症和线粒体功能障碍[J]. 中华危重病急救医学，2013，25（4）：254-256.
[3] 陶，尹海燕，马永辉. 姜黄素对脓毒症大鼠肝细胞线粒体膜通透性转换的作用机制研究[J]. 中华危重病急救医学，2014，26（9）：666-670.
[4] Deutschman CS，Cereda M，Ochroch EA，et al. Sepsis-induced cholestasis，steatosis，hepatocellular injury，and impaired hepatocellular regeneration are enhanced in interleukin-6 -/- mice[J]. Crit Care Med，2006，34（10）：2613-2620.
[5] 张杰，刘歆农，张培建，等. 白术多糖预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤后肝细胞线粒体结构的影响[J]. 肝胆胰外科杂志，2011，23（1）：4-6.
[6] Wichterman KA，Baue AE，Chaudry IH. Sepsis and septic shock-a review of laboratory models and a proposal[J]. The Journal of Surgical Research，1980，29（2）：189-201.
[7] 李志军，王东强，田永超，等. 2010德国脓毒症指南解读――关于脓毒症的预防、诊断、治疗及后续护理[J]. 中国危重病急救医学，2011，23（5）：257-262.
[8] Exline MC，Crouser ED. Mitochondrial dysfunction during sepsis：Still more questions than answers[J]. Critical care medicine，2011，39（5）：1216-1217.
[9] Albuszies G，Radermacher P，Vogt J，et al. Effect of increased cardiac output on hepatic and intestinal microcirculatory blood flow，oxygenation，and metabolism in hyperdynamic murine septic shock[J]. Crit Care Med，2005， 33（10）：2332-2338.
[10] Sakaguchi S，Furusawa S. Oxidative stress and septic shock：metabolic aspects of oxygen-derived free radicals generated in the liver during endotoxemia[J]. FEMS Immunology and Medical Microbiology，2006，47（2）：167-177.
[11] Shilo S，Aronis A，Komarnitsky R，et al. Selenite sensitizes mitochondrial permeability transition pore opening in vitro and in vivo：A Possible mechanism for chemo-protection[J]. The Biochemical Journal，2003，370（Pt 1）：283-290.
[12] Crouser ED，Julian MW，Huff JE，et al. Abnormal permeability of inner and outer mitochondrial membranes contributes independently to mitochondrial dysfunction in the liver during acute endotoxemia[J]. Critical Care Medicine，2004，32（2）：478-488.
[13] Garrabou G，Moren C，Lopez S，et al. The effects of sepsis on mitochondria[J]. The Journal of Infectious Diseases， 2012，205（3）：392-400.
[14] 冯文明，鲍鹰，朱鸣，等. δ阿片受体激动剂对脓毒症大鼠血液动力学和氧代谢的影响[J]. 中华麻醉学杂志，2011，31（4）：491-493.
[15] Tang CW，Feng WM，Du HM，et al. Delayed administration of D-Ala2-D-Leu5-enkephalin，a delta-opioid receptor agonist，improves survival in a rat model of sepsis[J].The Tohoku Journal of Experimental Medicine，2011，224（1）：69-76.
（收稿日期：2015-01-22）