固定化蛋白酶法制备低苦味蛋白质水解物的研究

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摘要：目的用固定化蛋白酶制备低苦味蛋白质水解物。方法将中性蛋白酶(neutral protease，NP)和复合蛋白酶(protamex，PM)共价固定到经戊二醛预处理的壳聚糖上，所得固定化蛋白酶于50℃催化酪蛋白分解。结果固定化中性蛋白酶(INP)和固定化复合蛋白酶(IPM)的活性回收率分别为59.9％和35.0％：重复使用10次(10h／次)后，INP和IPM的酶活性仍分别保存70.0％和79.8％。用IPM和INP制备的蛋白质水解物的水解度分别达到9.4％和26.5％，苦味值分别为4级和2级。用1NP制备的蛋白质水解物与用游离PM制备的蛋白质水解物的水解度和苦味值基本相同。结论使用固定化蛋白酶制备低苦味蛋白质水解物的水解度和苦味值都能达到食品蛋白质水解物的质量要求。

关键词：中性蛋白酶：复合蛋白酶；水解度：固定化酶；苦味值

中图分类号：TQ936.1

文献标识码：A

文章编号：1672-979X(2010)09-0305-03

用蛋白酶催化水解蛋白质，可提高其溶解性和热稳定性，防止酸沉淀，还可以改进食品的风味。蛋白质水解物可用于各类食品和方便食品调味料中。酶法水解蛋白质具有效率高、条件温和、营养成分不破坏等优点，是目前国内外用于食品生产的主要方法。但酶法水解蛋白质会产生主要由疏水氨基酸组成的小分子多肽，有苦味，影响了产品的口感。目前国内食品企业主要使用丹麦诺维信公司的复合蛋白酶和风味酶，用国产酶制剂生产的蛋白质水解物苦味较重。用低成本工艺生产水解度高的低苦味或无苦味的蛋白质水解物，是目前急需解决的问题。固定化酶具有稳定性好，带入杂质少等优点，仅需简单过滤即可重复使用，可降低生产成本。本研究以酪蛋白为实验材料，用固定化蛋白酶制备蛋白质水解物，探索水解度高、苦味少、成本低、杂质少，能达到食品工业质量要求的蛋白质水解物制备方法。

1材料

中性蛋白酶(neutral protease，NP)从本实验室保藏的产蛋白酶菌株提取；复合蛋白酶(protamex，PM)丹麦诺维信公司产；其它试剂均为国产分析纯。

2方法

2.1溶液配制

酪蛋白溶液：取酪蛋白5 g，加蒸馏水60 mL，3 mol／L氢氧化钠1.8 mL，沸水浴加热至溶解，调pH 7.0，定容至100 mL：茚三酮溶液：取茚三酮1.0 g，果糖0.06 g，用95％乙醇溶解并定容到100 mL：三氯乙酸溶液：取三氯乙酸1.8 g，无水乙酸钠2.99 g，冰乙酸1.89 mL，加蒸馏水溶解并定容至100 mL。

2.2固定化载体的制备

取壳聚糖1.0 g，加蒸馏水200 mL，冰乙酸4 mL，37℃振荡4 h至溶解。调pn 7.0，析出壳聚糖，加25％戊二醛2 mL，37℃振荡反应4 h，所得活化壳聚糖用蒸馏水充分洗涤15次以上，吸干水分后于－20℃保存。

2.3固定化酶的制备

活化壳聚糖加蛋白酶溶液，30℃振荡反应30 min后，离心去上清，沉淀用蒸馏水洗涤10次以上，得固定化酶。

2.4酶活性测定

取5％酪蛋白0.0 mL，加入酶液100 gL，50℃振荡反应10 min，加入900 p_L三氯乙酸溶液终止反应，离心后取上清测A275，计算酶活性。

固定化酶活性回收率(％)=固定化酶总活性／游离酶总活性×100％。

酶活性定义：在上述反应条件下，每1 min产生的氨基酸和肽的A275增加值相当于1ug酪氨酸A所需的酶量为1个酶活性单位(u)。

2.5苦味值的评定

参考陶红等的方法，蛋白质水解液由有经验者品尝，评定结果分为1～5级，顺序为：无苦味，微苦，较苦，苦，很苦。

2.6蛋白质水解度(degreeofhydrolysis，DH)的测定

取蛋白质水解液100ul(以未水解蛋白质溶液为对照)，加磷酸氢二钠.柠檬酸缓冲液(pH 5A)800ul，茚三酮100ul，混匀后沸水浴加热15 nm，冷却15 nlh后测A，参考赵新淮等的方法计算DH。

3结果与分析

3.1固定化酶活性回收率

取活化壳聚糖0.15g，加入NP 1 mL(2580U／mL)，反应后分别测定上清液和固定化酶的酶活性。结果表明，上清液剩余酶活性为14.2％，固定化中性蛋白酶(INP)酶活性回收率为59.9％；取活化壳聚糖0.2 g，加入PM l mL(2 360U／mL)，反应结果表明，上清液剩余酶活性为23.8％，固定化复合蛋白酶(IPM)酶活性回收率为35.0％(图1)。上清液剩余酶活性和固定化酶活性之和低于出发酶液的总活性，可能是因固定化酶受空间结构限制，不能与底物自由接触；IPM酶活性回收率很低，可能是因诺维信PM由多种不同的酶组成，其中某些酶不能被活化壳聚糖固定。

3.2固定化酶的稳定性

50℃下用固定化酶分解5％酪蛋白10 h。离心回收固定化酶，洗涤后再重复使用9次。结果表明，使用10次后INP和IPM的酶活性仍分别保存70.0％和79.8％，表明2种固定化酶都具有较高的稳定性。

3.3固定化酶法制备低苦味蛋白质水解物

3.3.1用INP和IPM制备低苦味蛋白质水解物分别取1NP O.15，0.30，0.45，0.60 g和IPM 0.8，1.2，1.6，2.0，4.0 g，分别加5％酪蛋白10mL，50℃反应6h，离心取上清，测DH。结果表明，蛋白质水解物的DH随固定化酶用量增加而增加，其中用INP制备，DH快速增加，可达到26.5％(图2)，苦味值2级：用IPM制备，DH增加缓慢，低于10％(图3)，苦味值4级；用IPM制备，DH和苦味值的质量指标均较低，可能是因IPM中只有诺维信复合蛋白酶的一部分，固定化的酶中还有一部分未充分表现其活性，所以酶切位点大量减少。

3.3.2比较用INP和游离PM制备的低苦味蛋白质水解物取INP 0.45 g和PM 50 mg，分别加5％酪蛋白10 mL，于50℃反应1，2，4，6，8 h，离心，测上清水解度。结果表明，DH随着反应时间的延长而增加，INP制备的蛋白质水解物的DH快速增加，游离PM制备蛋白质水解物的DH缓慢增加(图4)，反应8h后两者DH都达到25％，苦味值都是2级，但后者的苦味稍低于前者。表明用INP和游离PM制备所得蛋白质水解物的DH和苦味值基本相同。

4讨论

本研究所用的中性蛋白酶，推测其粗酶由多种内切和外切蛋白酶组成。以壳聚糖为载体固定该中性蛋白酶粗酶，上清液剩余酶活性仅约14％，而所得固定化酶的活性约为出发酶液活性的60％，表明固定化效率较高。用该固定化酶水解酪蛋白的实验结果表明，所得水解液的DH较高，苦味值低，与诺维信复合蛋白酶液态酶的使用效果相当，基本上能达到食品工业生产蛋白质水解物的质量要求，表明用固定化蛋白酶水解酪蛋白等可溶性蛋白是完全可行的。将固定化蛋白酶用于水解鸡肉、牛肉等固态蛋白还有待于进一步研究；将起脱苦作用的风味蛋白酶固定化，然后用于已液化的鸡肉水解液脱苦，理论上是完全可行的，也有待进一步研究。如果先将不同来源的蛋白酶固定化，再将固定化酶混合使用，可能水解效果会更好，苦味会更低。固定化酶一方面可有效地降低生产成本，另一方面基本上不添加任何杂质到蛋白质水解液中，具有很好的应用前景。

本实验结果表明，以壳聚糖为载体固定诺维信复合蛋白酶的效果不好，DH和苦昧这两方面的质量都不理想。根据我们前期的实验结果，木瓜酶和菠萝酶等相当一部分酶固定到壳聚糖的效率极低，其中原因较复杂，可能是因酶的表面缺少游离的氨基，也可能是因带正电的酶(例如木瓜酶和菠萝酶的等电点都较高，在中性条件下带正电)与带正电的壳聚糖颗粒相互排斥，导致酶和载体之间难于接近和吸附。