重金属毒作用发展方向
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作者：张叶蒋旭超钱海马静陆荣柱单位：江苏大学基础医学与医学技术学院预防医学系
内质网是在细胞中由膜围成的亚细胞器，是一个连续的膜囊和膜管网。真核细胞的内质网对大约1/3的新合成蛋白质进行修饰、折叠和寡聚化，从而使之形成正确的构象，参与脂质代谢和类固醇激素的合成以及钙的储存，因而内质网稳态的改变必将影响细胞功能，但细胞机体也拥有一条适应性通路即内质网应激(endoplasmicreticulumstress，ERS)来应对内质网功能紊乱[1]。内质网应激可以由多种干扰内质网功能的病理生理改变以及其他环境因素变化引起，如内质网腔内未折叠蛋白、错误折叠蛋白或多余蛋白过多、脂类或糖脂代谢失衡、内质网腔的氧化还原以及钙离子等离子条件的改变，而各种化学污染物也已成为重要的诱发内质网应激的外界环境因素。在自然界，金属与两性金属的比重大约占80%。其中，一些金属（如砷、汞、铅、砣）只要在体内蓄积就会产生潜在的毒性；另一些金属通过与氧、硫化物或氯化物形成化合物而具有毒性[2]。目前，金属污染严重是我国面临的主要环境问题。另外，在日常生活和职业活动中，人们也不可避免地接触一定量的金属，但由于金属引起的毒性机制尚不十分清楚，目前尚缺乏有效的防治方法。因而探讨内质网应激与金属毒性的关系有助于探讨金属毒性机制，促进金属毒理学的发展。本研究将以几种常见的金属（如铅、镉、汞及甲基汞、铝、铁、锰、铬、镍、铀）作一综述，为揭示常见金属神经毒性下内质网应激的发生特点和开发相应的化学保护剂提供参考资料。
1内质网应激及其相关的细胞应答信号通路
ERS是指细胞内质网钙稳态失调或蛋白质加工运输障碍，引起生理功能紊乱所致的一种亚细胞器应激反应过程。ERS可引起三种细胞应激效应：未折叠蛋白反应（UPR），内质网超负荷反应和固醇调节级联反应。内质网应激通过激活这三条通路产生下游的五类内质网应激效应：（1）诱导内质网葡萄糖调节蛋白78及94（GRP78及GRP94）等分子伴侣蛋白的表达，促进错叠与未折叠蛋白恢复正常构象、维持内质网和胞质Ca2+平衡；（2）抑制蛋白质翻译，减轻内质网新生蛋白加工的负担；（3）激活NF-κB的效应，可能促进抗炎反应；（4）影响脂类代谢，进而可能影响生物膜合成；（5）持续过强的内质网应激诱导细胞凋亡，内质网既含有促进凋亡的因子如半胱氨酸蛋白水解酶-12（Caspase-12）、生长停滞和DNA损伤诱导基因-153（CHOP/GADD153）等，也含有抑制因子如Bax蛋白抑制剂-1(BaxinhibitorI)、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、蛋白质二硫键异构酶（PDI）等。当内质网应激过强时，促凋亡机制占主导，能够独立地诱导细胞凋亡，其中，Caspase-12是内质网应激致凋亡的特异性标志[3，4]。在三种ERS反应中，UPR最为常见，研究也最为深入。UPR通过激活其下游三条信号通路来应对相应的应激（图1）。UPR的三条信号通路分别由三种类型的ER驻留蛋白起始：1型ER跨膜蛋白激酶(IRE1)、双链RNA依赖的蛋白激酶样ER激酶(PERK)和活化转录因子6(ATF6)。IRE1信号通路：当内质网应激发生时，IRE1蛋白与GRP78分离，IRE1激酶结构域的反式自磷酸化活化自身的内切核酸酶活力，然后内切核酸酶精确切割其唯一底物———酵母中人工染色体(mRNAHAC1)或多细胞动物中x-box连接蛋白1(XBP1)；剪接后，有活性的部分转位入胞核，帮助伴侣蛋白的转录。通过这一通路不仅编码ER蛋白，折叠和修饰相关的酶，促进磷脂的合成，还包括编码与膜泡运输有关的蛋白，从而有利于非折叠蛋白的正确折叠。PERK信号通路：PERK与GRP78分离后，PERK激酶磷酸化真核转录起始因子-2的α-亚基(eIF2α)，从而阻断蛋白合成，降低了去往ER的蛋白量，最终减轻了ER进行蛋白加工的负担。磷酸化的eIF2可以优先起始特定mRNA的翻译（如ATF4mRNA）。
而这种mRNA基因上的特殊结构起着重要的协调作用。ATF6信号通路：ATF6与GRP78分离后，ATF6包被在膜泡中从ER转移到高尔基体中，并在高尔基体内先后被S1P和S2P蛋白酶水解，释放胞质脱氧核糖核酸结合区即ATF6f，然后ATF6f转位入核，激活基因表达。ATF6引起内质网应激元件基因启动子区域激活，转录出的蛋白包括伴侣蛋白GRP78和GRP94、蛋白二硫异构酶(proteindisulphideisomerase，PDI)、转录因子CHOP和Xbox-bindingprotein1（XBP1），从而有利于内质网内非折叠蛋白恢复正确构象。
2内质网应激与几种常见人体非必需金属毒性的关系
2.1铅
2.1.1神经细胞在大鼠神经胶质瘤细胞（C6细胞）中，铅暴露可上调GRP78的mRNA和蛋白水平的表达，这可能和GRP78与铅可紧密结合，将铅隔离于非毒性位点有关；这也可能是内质网应激对铅毒性的保护机制[6，7]。有研究发现，当以0.1和1μmol/L的铅处理C6细胞7d后，其GRP78mRNA水平上调到对照组的2.5～3倍；而当以10μmol/L的铅处理C6细胞7d后，Grp78mRNA水平下调，与对照组相比减少40%，这可能与高浓度铅抑制内质网应激相关；同时发现，经铅处理的GRP78蛋白水平具有剂量和时间效应[7]。张莹等[8]的研究结果显示，铅可以使C6细胞的Grp78蛋白表达增加；在0.2μmol/L铅染毒组中，染毒7和30d的GRP78蛋白表达显著增高，其余各个时间点均无显著性变化；但在1.0μmol/L铅染毒组中，染毒1d后GRP78蛋白表达量开始显著增高，铅染毒30d时已达到铅染毒前的6.3倍；在2.0μmol/L铅染毒组中，0.5h开始GRP78蛋白表达量即显著增高，铅染毒7d时达到高峰，是铅染毒前的4.3倍，到30d时表达量又下降为铅染毒前的2.6倍。这可能是由于高表达的GRP78蛋白能与铅结合，将铅大量蓄积于神经胶质细胞中，从而可能对更为敏感的神经元和其他细胞提供保护；但在2.0μmol/L铅染毒30d时，GRP78蛋白表达量下降，说明在铅达到一定浓度且在胶质细胞中蓄积到一定量后，细胞的整体功能受损，蛋白质表达下降[8]。Qian等[9]采用Northern印迹方法分析1μmol/L铅处理原代培养两周的大鼠星形胶质细胞1周后的GRP78基因表达，发现处理组的GRP78基因表达与对照组相比明显上调。
2.1.2血管内皮细胞铅（2～25μmol/L）处理血管内皮细胞24h后，发现GRP78和GRP94在基因和蛋白水平上的表达上调，并具有剂量-效应关系；同时发现，经10μmol/L铅处理后，GRP78和GRP94蛋白的表达上调，并具有时间-效应关系；同时，该研究进一步发现，铅可通过c-Jun氨基端激酶-活化蛋白-1（JNK-AP-1）通路引起血管内皮细胞中GRP78和GRP94蛋白的上调，这些内质网应激特异蛋白表达的上调提示了内质网应激的发生[10]。
2.1.3NRK-52E细胞Stacchiotti等[11]以肾小管细胞株NRK-52E为模型研究了铅诱导的肾中毒，发现60和300μmol/L的氯化铅不能上调Hsp72蛋白的表达，但能诱导GRP78蛋白的表达上调，从而提示铅可选择性诱导内质网应激的发生。在重组体肝癌细胞HepG2中，铅暴露也可诱导GRP78和GADD153基因启动子的上调，且具有剂量效应；在硝酸铅浓度为100μmol/L时，GRP78基因启动子上调到空白对照组的3倍[12]。
2.1.4体内研究除了以细胞为研究对象外，也有研究通过建立低水平铅暴露模型分析宫内和哺乳期低水平铅暴露对子代大鼠白细胞GRP78蛋白表达量的影响，探讨铅对内质网应激的影响，结果发现，母鼠从前30d起每天被灌胃1ml(10mg/ml)乙酸铅溶液后，哺乳期低水平铅暴露致使内质网应激的标志性蛋白GRP78蛋白表达增加；提示母鼠体内的铅可以通过妊娠和哺乳输送到仔鼠的不同器官，从而改变白细胞GRP78蛋白的表达；推测母源性血铅浓度的升高可改变幼鼠白细胞中GRP78蛋白的水平，这可能是铅影响免疫功能的机制之一[13]。
2.2镉
2.2.1肾细胞Liu等[14]以LLC-PK1肾脏上皮细胞为研究对象评价了镉对GRP78蛋白表达的影响，发现在用10μmol/L氯化镉处理的细胞中，GRP78蛋白水平在6h开始升高，并持续升高到24h；当用1～20μmol/L的氯化镉处理细胞6h，GRP78蛋白的表达呈剂量依赖性增加；同时，氯化镉处理引起URP下游激活蛋白ATF4和磷酸化eIF2的增加。另外也有研究显示，在肾小球细胞中，内质网应激的标志性蛋白GADD153的表达在镉暴露后4h开始上调，内质网相关的凋亡基因Caspase-12及下游的Caspase-3在镉暴露后16h被激活[15]。
2.2.2肝细胞以内质网应激反应性碱性磷酸酶(ERstress-responsealkalinephosphatase，ES-TRAP)为内质网应激发生的灵敏生物标志物，Hiramatsu等[16]分别从体内、体外两个方面探讨了重金属（镉、钴、镍等）和内质网应激的关系：在体外试验中，以可以稳定表达ES-TRAP的大鼠肾脏NRK52E细胞和小鼠肝Hepa-1c1c7细胞为模型，给予氯化镉处理6h后，发现镉可以诱导内质网应激的发生，并且表明ES-TRAP作为重金属诱导内质网应激发生的标志物比其他内质网分子伴侣标志物敏感；在体内试验中，以ES-TRAP转基因小鼠为模型，发现急性暴露氯化镉6h以后，肝脏和肾脏GRP78蛋白的表达显著增加，并在24h恢复到正常水平，同时，急性镉暴露可导致血清ES-TRAP活力快速下降，与肝脏和肾脏中内源性内质网应激标志物的表达趋势相反。
2.2.3其他研究有研究发现，15或30μmol/L镉处理NIHSwiss小鼠胚细胞（NIH3T3细胞）3、6、9、12h后，可以引起内质网结构发生不同程度地改变，使Caspase-12被激活，且呈剂量-反应关系；并可抑制细胞基质内质网钙-ATP酶活力，诱导细胞凋亡，提示内质网与线粒体共同参与镉诱导的细胞凋亡[17]。
同时，有研究发现，甲状腺细胞给予镉一次性处理后，再连续进行镉处理则可增强内质网伴侣蛋白GRP94的诱导表达，且明显高于一次性预处理和空白对照，这可能与镉预处理改变了细胞的敏感性，后续镉的连续处理激活了细胞应激蛋白表达的镉特异性通路有关[18]。另外，Schroder等[19]以寄居蟹皮海绵为研究对象进行0.01、0.1、1mg/L氯化镉分别处理0.5、1、3、6d，发现寄居蟹皮海绵能够蓄积大量的镉，导致DNA单链断裂以及上调GRP78蛋白的表达，并且都具有时间-和剂量-效应关系。
2.3汞和甲基汞
在体外的研究中，Qian等[7]用氯化汞（Hg）处理C6细胞7d，发现1μmol/L的Hg就可引起GRP78mRNA水平显著性升高，达到对照组的2.5倍,但当处理浓度达10μmol/L时，GRP78mRNA水平显示了下降趋势；就GRP78蛋白水平而言，1μmol/L的Hg就可显著增加GRP78蛋白含量，染毒浓度为10μmol/L的Hg则可使GRP78蛋白含量达到对照组的2倍；为进一步探讨无机汞诱导GRP78表达的机制，该研究采用凝胶迁移实验(EMSA)评价蛋白-DNA交互作用，发现经Hg处理细胞的抗氧化反应元件、激活因子和核因子KappaB(NF-κB)与相应蛋白的结合能力增强，而且由于这些因子与抗氧化有关，因而提示氧化应激参与了Hg诱导的内质网应激反应。有研究发现，在甲基汞暴露14～16h的凋亡细胞中检测到Caspase-12被激活，并发现内质网应激在甲基汞暴露9h后发生，而在甲基汞暴露早期（2～3h）细胞内的活性氧增加，提示内质网应激是发生在甲基汞细胞毒性的晚期事件，并且氧化应激可能是诱导内质网应激的原因之一[20]。
2.4铝
Ghribi等[21]研究发现，在兔腹腔注射含铝25mmol/L的AlCl3溶液15d后，海马GADD153和转录因子NF-K的核转位增多；同时，在内质网和细胞核中，伴随着这两种蛋白的核转位，Bcl-2的表达水平降低；该研究还发现，铝暴露可激发内质网特异凋亡蛋白Caspase-12的活力。张勤丽等[22]研究发现，以0.5、1.0、2.0mmol/L氯化铝能诱导神经元凋亡，并能引起内质网的变形肿胀及脱颗粒现象，提示铝对内质网可产生应激效应。另外，在去除培养液中的钙离子和使用钙通道抑制剂的情况下，Snyder等[23]对麦芽酚铝的肝细胞毒性进行了研究，结果发现，利用毒胡萝卜内酯促进内质网中的钙离子外流会降低麦芽酚铝对肝细胞的损伤，从而提示内质网应激参与了铝的细胞毒性。
3内质网应激与常见人体必需金属的关系
3.1铁
在生物体内，铁是机体必需的微量元素，但铁过量会引起组织损伤。Lou等[24]以大鼠为模型，每天腹腔注射葡聚糖铁30mg/kg，持续9周，结果发现，与对照组相比，心脏和肝脏中GRP78蛋白表达量和Caspase-12活力上调；同时，一次性腹腔注射300mg/kg葡聚糖铁，发现在心脏和肝脏中GRP78蛋白的表达也显著上调，提示内质网应激在铁引起的组织损伤中具有重要的作用。最近一项研究是以HepG2细胞株为模型，利用氧化型二硫苏糖醇(DTT)和高半胱氨酸诱导其内质网应激来揭示内质网应激对铁稳态相关基因表达的影响，发现伴随着非折叠蛋白反应，由肝脏分泌的调节铁稳态的肝脏抗菌多肽水平表现为二相性：在非折叠蛋白反应早期，肝脏抗菌多肽水平降低；在应激反应的持续阶段，肝脏抗菌多肽水平提高；这证明了内质网应激对于细胞内铁稳态的意义[25]。
3.2锰
Chun等[26]以500μmol/LMnCl2处理多巴胺能细胞株24h，结果发现，其诱导的黑质多巴胺能神经元SN4741细胞的神经毒性由内质网应激反应介导，诱导内质网的分子伴侣GRP78蛋白水平升高，同时，激活内质网的特异凋亡蛋白Caspase-12。Oubrahim等[27]发现，0.5和1.0mmol/L锰(Ⅱ)作用24h可引起NIH3T3细胞凋亡的过程中，有Caspase-12的参与；同时发现，在Caspase-12基因敲除后，在NIH3T3细胞中不发生凋亡，表明Caspase-12在锰(Ⅱ)引起的NIH3T3细胞凋亡中起关键作用。
3.3铬
目前，对铬与内质网应激关系的研究主要集中于对糖尿病的研究。一些研究发现，内质网应激参与了铬提高机体糖耐量和减轻胰岛素抵抗的机制。Sreejayan等[28]对肥胖小鼠进行D-型苯基丙氨酸铬[Cr(D-phe)3]处理，结果发现，与空白对照组肥胖小鼠相比，处理组的内质网应激的下游蛋白(p-PERK、p-IRE和p-eIF2α)的表达量减少，提示内质网应激参与了铬对胰岛素抵抗的缓解作用；同时，该小组还研究了在毒胡萝卜素诱导肌管产生内质网应激的情况下Cr(D-phe)3处理的影响，发现在Cr(D-phe)3处理后，内质网应激的标记物p-eIF2α的表达受到抑制，进一步提示调节内质网应激反应可能是铬的保护作用机制。
4其他金属
对于铀和镍等其他金属与内质网应激的关系也有一些研究，但主要是描述内质网应激反应，未能进行深入的机制研究。贫铀在军事上的运用使得关于贫铀毒性的研究越来越多，其中，Miller等[29]发现，5～50μg/ml贫铀处理HepG2细胞48h，可以上调内质网应激的标志性蛋白GRP78的启动子并具有剂量依赖性。镍一般都是以镍合金的形式被应用。有研究发现，镍合金的毒性比组成它的任何一种金属单独的毒性都强，并且镍合金的毒性存在一定的剂量效应，用不同浓度（0.5、1.25、2.5和5μg/ml）镍暴露HepG2细胞48h，结果显示，可以引起内质网应激的标志性蛋白GRP78和HSP70启动子剂量依赖性的升高[29]。
5小结及展望
本研究从人体内非必需金属到必需金属两个方面概述了内质网应激与其毒性的关系，提示了内质网应激在重金属的毒性机制中起到一定作用。通过对铅、镉、汞、铝、铁、锰、铬、镍、铀等重金属毒性的比较，推测氧化性损伤、钙稳态失调以及与GRP78等内质网分子伴侣的直接结合可能是重金属诱导内质网应激的共同机制。实际上，重金属诱导内质网应激有其共同特点，即在适应性调节阶段或称激发阶段，无论是剂量-效应关系还是时间-效应关系GRP78蛋白表达水平与空白组相比都呈先上升后下降的趋势。并且内质网应激通路中的下游蛋白p-PERK、p-eIF2α、ATF6等也呈现相应变化趋势，早期或轻度的反应可以诱导保护性适应反应。但是如果持续的或剧烈的内质网应激也能够激发程序性细胞死亡。内质网应激引起的程序性死亡机制是通过GADD153、CHOP和Caspase-12等介导的。但目前对于内质网应激在金属毒性机制研究中的具体作用机制研究仍以体外研究为主，选择各种金属的靶器官或靶细胞进行系统的体内研究相对较少，这就限制了相关毒性机制研究的拓展，也不能明确内质网应激通路激活究竟是毒性的表现，还是对金属毒性的保护性反应，因而内质网应激与金属毒性的关系值得进一步研究，并且在研究方法上需要完善，也只有获得良好的研究模型和可靠的效应评价体系，才能为内质网应激的人群研究提供足够依据。