应用PCR-反向斑点杂交快速鉴定分枝杆菌菌种
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[摘要] 目的:应用聚合酶链反应-反向斑点杂交法(pcr-RDBHA)快速鉴定分枝杆菌至种的水平。方法:以分枝杆菌rpoβ基因编码序列为靶基因,应用PCR-RDBHA检测126株分枝杆菌临床分离株。以PCR-DNA测序为对照,对经PCR-RDBHA鉴定为非结核分枝杆菌(NTM)的临床分离株进行PCR-DNA测序。结果:126株临床分离株中,经鉴定115株(91.3%)为结核分枝杆菌复合群(MTC),11株(8.7%)为NTM。NTM中,4株胞内分枝杆菌,1株堪萨斯分枝杆菌,1株戈登分枝杆菌,2株瘰疬分枝杆菌,3株脓肿分枝杆菌。11株NTM PCR-RDBHA与PCR-DNA测序结果一致。结论:PCR-RDBHA能鉴定分枝杆菌临床分离株至种的水平,方法简便、快速,结果准确,具有良好的临床应用价值。
[中图分类号] R378.91[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2010)03(c)-035-02
PCR-reverse dot blot hybridization assay for rapid identification of Mycobacterium species
ZHANG Xiaojuan
(Thorax Disease Hospital of Shenyang, Shenyang 110044, China)
[Abstract] Objective: To identify Mycobacterium species rapidly by polymerase chain reaction-reverse dot blot hybridization assay (PCR-RDBHA). Methods: 126 mycobacterial clinical isolates were detected by PCR-RDBHA based on the sequence of rpoβ gene. PCR-DNA sequencing of the nontuberculous mycobacteria (NTM) identified by PCR-RDBHA was performed as control. Results: Among 126 isolates, 115 (91.3%) were determined to be M.tuberculosis complex (MTC), 11 (8.7%) to be NTM which contained 4 M.intracellulare, 1 M.kansasii, 1 M.gordonae, 2 M.scrofulaceum and 3 M.abscessus. The results of 11 NTM identified by PCR-RDBHA were in agreement with PCR-DNA sequencing. Conclusion: It is simple, rapid, accurate and valuable in clinical application that PCR-RDBHA is applied to identify mycobacterial clinical isolates to species level.
[Key words] Mycobacterium; Species identification; Polymerase chain reaction; Reverse dot blot hybridization assay
目前,常规的分枝杆菌菌种鉴定需采用分枝杆菌培养物进行生长特性试验(生长速度、生长温度、光产色试验、多种鉴别培养基上生长试验)及生化特性试验(耐热触酶试验、硝酸盐还原试验、烟酸试验、吐温-80水解试验、尿素酶水解试验、芳香硫酸酯酶试验、铁离子吸收试验、亚硝酸盐还原试验)等10余项试验,综合分析判定结果[1],方法复杂、费时,慢生长分枝杆菌需3～4周方可获得结果,且准确度较差,难以满足临床诊断和治疗的需要。本实验以分枝杆菌rpoβ基因为靶基因序列,应用聚合酶链反应-反向斑点杂交法(PCR-RDBHA)快速鉴定分枝杆菌临床分离株至种的水平,结果报道如下:
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 分枝杆菌分离株经抗酸染色涂片检测阳性的分枝杆菌临床分离株126株,来自我院结核科和第三九医院。
1.1.2 引物及探针引物Ⅰ和Ⅱ及21种分枝杆菌寡核苷酸探针序列参照文献[2]由上海生工生物工程有限公司合成。引物Ⅰ和Ⅱ扩增360 bp DN段。分枝杆菌属、结核分枝杆菌复合群、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、胃分枝杆菌、偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌、海分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、戈登分枝杆菌、苏加分枝杆菌、马尔摩分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、微黄分枝杆菌、土地分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、不产色分枝杆菌和草分枝杆菌菌种对应的探针分别命名为pMyc、pTub、pAvi、pInt、pKan、pAbs、pScr、pGas、pFor、pChe、pMar、pSim、pGor、pSzu、pMal、pXen、pFla、pTer、pSme、pNon和pPhl。
1.2 方法
1.2.1 DNA模板制备刮取改良罗氏培养基上的分枝杆菌临床分离株培养物少许,混悬于含1 ml无菌TE缓冲液的1.5 ml离心管内,10 000 r/min离心10 min,去上清,沉淀加入DNA提取液50 μl,煮沸15 min,离心取上清作为DNA模板。
1.2.2 PCR扩增在25 μl反应体系内,引物Ⅰ、引物Ⅱ终浓度各为0.2 μmol/L,4× dNTP终浓度各为0.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶1 U,10× PCR缓冲液2.5 μl,DNA模板3 μl,加去离子水至25 μl。置PCR扩增仪内,扩增条件为94℃变性5 min后,94℃ 1 min、58℃ 1 min和72℃ 1 min,循环35次,72℃延伸7 min。2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
1.2.3 探针加尾20 μl 5× 末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)反应缓冲液,探针终浓度为4 μmol/L,dTTP终浓度为2 mmol/L,TdT 80 U,加去离子水至100 μl,置37℃水浴2 h,加2 μl 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)终止反应。
1.2.4 反向斑点杂交①膜芯片制备:取加尾后探针2 pmol按顺序点于尼龙膜上(图1),置60℃干烤固定2 h。②杂交:将生物素标记的PCR产物煮沸变性5 min,冰浴5～10 min。将膜芯片放入反应袋中,加入杂交液(5× SSC,1% blocking试剂,0.1%十二烷基肌氨酸钠,0.02% SDS)5 ml,加入变性PCR产物15～20 μl,混匀,封袋。54℃孵育30 min。③洗膜芯片:洗液Ⅰ(2× SSC,0.1% SDS)室温洗膜2次,每次10 min;洗液Ⅱ(0.1× SDS,0.1% SDS)室温洗膜10 min 1次。④酶结合物与标记PCR产物结合:链亲和素-碱性磷酸酶结合物以适当比例稀释后与杂交后的膜芯片室温作用30 min。⑤洗膜芯片:缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl,pH 7.5)室温洗膜2次,每次10 min,缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl,100 mmol/L NaCl,50 mmol/L MgCl2,pH 9.5)室温洗膜10 min 1次。⑥显色:用BICP-NBT系统显色,待探针显色后,用TE洗膜终止反应。⑦结果观察:根据杂交斑点判定结果。
1.2.5 PCR-DNA测序对PCR-RDBHA鉴定为NTM的BACTEC-960培养物再次进行PCR扩增,将扩增产物纯化后送上海生工生物工程有限公司进行DNA测序。
2 结果
2.1 PCR扩增
引物Ⅰ和引物Ⅱ扩增从126株经抗酸染色阳性的分枝杆菌临床分离株培养物制备的DNA模板,2%琼脂糖凝胶电泳检测均可见360 bp DNA扩增条带。
2.2 RDBHA检测
PCR阳性扩增产物RDBHA检测结果表明:126株中,115株鉴定为MTC,11株为NTM。NTM中,1株堪萨斯分枝杆菌,1株戈登分枝杆菌,2株瘰疬分枝杆菌,4株胞内分枝杆菌,3株脓肿分枝杆菌,杂交结果见图1。
图1分枝杆菌菌种鉴定反向斑点杂交结果
(分枝杆菌菌种探针排列从左至右、上至下顺序依此为pMyc、pTub、pKan、pInt、pAvi、pGas、pMar、pGor、pScr、pSim、pSzu、pXen、pMar、pTer、pNon、pChe、pAbs、pFor、pSme、pPhl、pFla。A:MTC杂交结果;B:堪萨斯分枝杆菌杂交结果;C:胞内分枝杆菌杂交结果;D:戈登分枝杆菌杂交结果;E:瘰疬分枝杆菌杂交结果;F:脓肿分枝杆菌杂交结果)
2.3 PCR-DNA测序
11株NTM PCR-DNA测序序列与已知分枝杆菌标准菌株rpoβ基因序列进行同源性分析鉴定至种。以测序结果为对照,PCR-RDBHA与PCR-DNA测序鉴定结果一致。
3 讨论
分枝杆菌属包括MTC、麻风分枝杆菌和NTM。目前已报道100余种分枝杆菌,其中约30种与人或不同的动物疾病有关[3]。自20世纪80年代早期以来,结核病及NTM感染疫情在世界范围内呈上升趋势[4]。临床实验室检出NTM的几率正在增加。致病性NTM引起的NTM肺病与肺结核的临床表现、X线特征极其相似,但临床治疗方案不同,许多NTM对抗结核药物天然耐药,常规化疗效果不佳。因此,分枝杆菌菌种鉴定对临床诊断、鉴别诊断和治疗均有重要意义。
近年来,以PCR为基础的各种分子检测技术的发展,为分枝杆菌菌种鉴定提供了新的技术手段。临床上实用而具有开发价值的反向斑点杂交技术,在菌种鉴定检测方面已显示出极大优势。分枝杆菌rpoβ基因具有分枝杆菌属及种信息保守区和特异性可变区[5-6],以此为靶基因建立的PCR-RDBHA所扩增的rpoβ基因360 bp片段中含有2个序列高变区,不同分枝杆菌菌种间变异较大,利用差异设计的分枝杆菌属、MTC和19种NTM菌种寡核苷酸探针排列固定于尼龙膜载体上,与生物素标记的分枝杆菌菌种PCR扩增产物进行杂交,再与链亲和素-碱性磷酸酶结合物作用,显色后,根据杂交斑点判定结果,能将分枝杆菌鉴定至种的水平。
本实验应用PCR-RDBHA检测分枝杆菌临床分离株,结果表明,126株培养物中MTC 115株(91.3%),NTM 11株(8.7%),NTM的菌种鉴定及引起的疾病不容忽视。目前,DNA测序是公认的检测分子差异的最可靠方法,对不同分枝杆菌菌种间rpoβ基因特异性可变区的差异进行分析,能达到菌种鉴定的目的。本实验以PCR-DNA测序为对照,11株NTM PCR-RDBHA与PCR-DNA测序鉴定结果一致。结果表明,PCR-RDBHA鉴定分枝杆菌菌种简便,不需特殊仪器,易普及,快速,在获得分枝杆菌阳性分离株后1 d即可获得结果,且结果准确,具有良好的临床应用价值。
[参考文献]
[1]中国防痨协会基础专业委员会.结核病诊断实验室检验规程[M].北京:中国教育文化出版社,2006:52-68.
[2]樊博,王巍,李国利.应用rpoβ基因PCR反向斑点杂交快速鉴定分枝杆菌菌种的研究[J].中国防痨杂志,2006,28(4):212-215.
[3]王亚娟,冯萍,熊礼宽.分枝杆菌鉴定的分子生物学方法研究进展[J].临床肺科杂志,2009,14(3):353-355.
[4]熊礼宽.重视非结核分枝杆菌感染的实验诊断[J].临床肺科杂志,2009,14(11):1429.
[5]Kim BJ, Lee SH, Lyu MA. Identification of mycobacterial species by comparative sequence analysis of the RNA polymerase gene (rpoβ) [J]. J Clin Microbiol,1999,37(6):1714-1720.
[6]Lee H, Bang HE, Bai GH. Novel polymorphie region of the rpoβ gene containing mycobacterium species-specific sequences and its use in identification of mycobacteria [J]. Journal of Clinic Microbiology,2003,41(5):2213-2218.
(收稿日期:2009-11-30)