沙棘维生素C积累与相关酶活性关系研究
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摘要：探讨沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）不同器官中抗坏血酸（AsA）积累与相关代谢酶活性的关系。结果表明，AsA在沙棘幼叶和果实中含量较高，在茎和花中含量较低。沙棘幼叶和果实中AsA含量主要受L-半乳糖-1，4-内酯脱氢酶（GalLDH）和脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）活性调节，抗坏血酸氧化酶（AAO）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）对AsA的积累也有调节作用。
关键词：沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）；抗坏血酸（AsA）；L-半乳糖-1， 4-内酯脱氢酶（GalLDH）；抗坏血酸氧化酶（AAO）；抗坏血酸过氧化物酶（APX）；单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）；脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）
中图分类号：S793.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）01-0120-04
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.01.032
沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）属胡颓子科沙棘属植物，沙棘果实是中国古代藏医、蒙医的常用药物。中国是沙棘属植物分布面积最大、种类最多的国家[1，2]。沙棘果实中维生素C含量高，素有“维生素C之王”的美称。维生素C又名抗坏血酸（Ascorbic acid，AsA），可以作为辅酶在植物光合作用、细胞分裂和生长代谢中发挥重要作用[3-5]，同时AsA也是植物和大多数动物体内一种重要的抗氧化剂，人类由于缺乏其合成关键酶而不能合成AsA，只能从食物中获取，因此AsA是植物重要的营养指标之一[6，7]。
Wheeler等[7]提出植物体内合成AsA的途径中，L-半乳糖-1，4-内酯脱氢酶（GalLDH）直接催化半乳糖内酯形成AsA，是AsA生物合成途径的关键酶，GalLDH基因表达水平决定了AsA含量的高低。最近的研究结果也表明，过量表达GalLDH可以提高烟草BY-2细胞中AsA含量[8]，反义表达GalLDH mRNA导致GalLDH活性显著下降，以及AsA含量的下降[9]。在植物细胞内，抗坏血酸氧化酶（AAO）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）是AsA代谢过程中主要的氧化分解酶[10]，这2种酶分别在O2和H2O2的参与下将AsA氧化为不稳定的单脱氢抗坏血酸（MDHA），MDHA既可在单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）的作用下还原为AsA，也可发生非酶歧化反应形成脱氢抗坏血酸（DHA），DHA可以通过脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）的作用被还原为AsA，因此植物体内这4种与AsA代谢相关的酶活性也将影响AsA水平的高低[3，6，10，11]。目前有关沙棘维生素C积累的生理机制尚不清楚，为此，本研究通过测定8年生沙棘生长过程中AsA与相关代谢酶活性的关系，以期一定程度上揭示沙棘AsA积累的生理机制。
1 材料与方法
1.1 材料
以青海省祁连县野牛沟乡达玉村种植的8年生沙棘为研究对象，在沙棘发芽、长叶、结果期，采集同一株沙棘上部枝条顶端的叶、茎、果实，去杂质后称重，液氮速冻后置-80 ℃保存备用。沙棘幼叶、幼茎于6月下旬采集，花于7月中旬采集，幼果于8月中旬采集，成熟果实于9月上旬采集。
1.2 方法
1）AsA含量测定。参考Arakawa等[12]和戚元成等[13]的方法并略作改进。取0.3 g样本，加入3 mL 5%的TCA研磨成匀浆，4 000 r/min离心10 min，取上清液备用。测定时，5 mL反应体系中含有1 mL 5%的TCA、1 mL 50%的EtOH、0.5 mL 0.4%的H3PO4- EtOH、1 mL 5%的BP-EtOH、0.5 mL 0. 03%的FeCl3-EtOH和1 mL样品提取液。30 ℃水浴反应90 min，于波长534 nm处测吸光度。
2）GalLDH活性测定。参考Tabata等[8]、安华明等[11]和徐茂军等[14]的方法并略作改进。取0.5 g样本在液氮中研磨成匀浆分装至试管，加入3 mL 50 mmol/L的磷酸缓冲液（pH 7.8，含0.2 mmol/L Na2EDTA，2%的PVP），然后500 r/min离心10 min，收集上清，10 000 r/min离心20 min后收集沉淀。将沉淀轻悬浮于0.5 mL 50 mmol/L的磷酸缓冲液中，供酶活性测定用。以上操作均在4 ℃下进行。
测定时取2 mL 1.05 mg/mL的细胞色素c（Cytc）、200 μL 56 mmol/L的L-半乳糖内酯（L-galactono-1，4-lactone）和200 μL提取液，总体积2.4 mL。测定前先将反应混合液于25 ℃预温热1 min，于波长550 nm处测定吸光度，反应从加入L-半乳糖内酯后开始计时。以每分钟吸光度值增加0.01为1个酶活力单位。
3）AAO、APX以及MDHAR、DHAR活性测定。取0.5 g样品，用液氮匀浆并分装到离心管，再加入3 mL 50 mmol/L的磷酸缓冲液，12 000 r/min离心20 min，收集上清液备用。
AAO活性测定参考陈利锋等[15]的方法，取提取液0.12 mL，加入2.88 mL磷酸缓冲液（pH 7.8，0.5 mmol/L）在波长290 nm下测定；APX活性测定参考Nakano等[16]的方法，3 mL的反应体系中含有50 mmol/L Hepes-KOH（pH 7.6），1.0 mmol/L H2O2，0.5 mmol/L AsA及0.05 mL样品提取液，测定波长290 nm处吸光度的变化；MDHAR和DHAR活性测定参考Nakano等[16]、Ma等[17]的方法，测MDHAR活性时3 mL的反应体系中含有100 mmol/L Hepes-KOH（pH 7.6），0.1 mmol/L NADH，0.25 mmol/L AsA，0.3 units抗坏血酸氧化酶（AAO）及0.1 mL样品提取液，在波长340 nm条件下测定吸光度；测定DHAR活性时3 mL的反应体系含有50 mmol/L Hepes-KOH（pH 7.6），2.5 mmol/L GSH，0.2 mmol/L DHA及0.1 mL样品提取液，在波长265 nm条件下测定吸光度。
以上各生理指标的测定均重复3次，含量以鲜重计，试验数据采用SAS软件Duncan多重比较法（α=0.05）进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 沙棘不同器官中AsA的含量
从图1可以看出，沙棘不同器官中AsA含量差异明显。沙棘幼叶中ASA含量最高，其次是幼果和成熟果实，幼茎和花中含量最低。幼叶中AsA含量分别是幼果、成熟果实、幼茎、花中的1.26、1.35、164.79、149.06倍。结果表明，沙棘AsA含量在叶时期较高，茎时期较低，进入果实期后呈先上升后下降趋势。
2.2 沙棘不同器官中GalLDH活性变化
如图2所示，沙棘幼叶和幼茎中GalLDH活性差异显著，幼叶中GalLD含量最高，其次是幼果、花、成熟果实，幼茎中GalLDH含量最低。幼叶中GalLDH含量分别是幼茎、花、幼果、成熟果实中的1.49、1.21、1.10、1.33倍。幼叶、花、幼果、成熟果实之间差异不显著。
2.3 沙棘不同器官中AAO和APX活性变化
沙棘不同器官中AAO与APX活性变化见图3。从图3可以看出，幼叶和果实中AAO与APX活性较高，幼茎和花中含量较低。其中成熟果实中AAO活性是幼叶、幼茎、花、幼果中的0.91、2.50、3.95、1.00倍；成熟果实中APX活性是幼叶、幼茎、花、幼果中的1.19、3.22、5.19、1.03倍。二者呈现高度正相关（表1），相关系数为0.98。
2.4 沙棘不同器官中MDHAR与DHAR活性变化
沙棘不同器官中MDHAR活性和DHAR活性的变化见图4。从图4可以看出，幼叶中MDHAR活性最高，其中幼叶中MDHAR活性是幼茎、花、幼果、成熟果实中的1.40、2.33、1.30、1.59倍；幼叶DHAR活性是幼茎、花、幼果、成熟果实中的7.56、3.09、4.25、4.25倍。花中MDHAR活性最低，幼茎中DHAR活性最低。
2.5 沙棘果实发育时期AsA代谢相关指标间的相关性
Excel程序分析结果表明（表1），沙棘果实发育时期AsA与GalLDH、APX呈高度正相关，相关系数为0.92～0.98；AsA与AAO、MDHAR、DHAR呈显著正相关，相关系数为0.58～0.74。沙棘GalLDH活性与AsA含量变化趋势基本一致，两者之间呈极显著正相关，表明沙棘AsA的积累主要受GalLDH的调节。
3 小结与讨论
GalLDH和DHAR是沙棘维持其体内正常的AsA水平及其还原活性的重要酶，沙棘幼叶和果实中AsA的积累主要来自GalLDH催化的生物合成和DHAR催化的DHA还原。此外，抗坏血酸氧化酶（AAO）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）是植物体内AsA代谢过程中主要的氧化分解酶[9]，它们分别在O2与H2O2的参与下将AsA氧化成不稳定的单脱氢抗坏血酸（MDHA），进而形成DHA。本研究中发现，沙棘AAO与APX活性变化趋势与AsA的积累过程不同，前期一致，在果实期AsA积累降低而这两种酶活性升高，表明在整个时期中，沙棘叶、茎积累的AsA被快速氧化，而在进入果实期后，果实中积累的AsA只有极少被氧化。
AsA被AAO与APX氧化为MDHA与DHA，而MDHAR和DHAR可使AsA由氧化态还原再生为还原态。Chen等[18]研究发现DHAR的增强表达可使烟草和大麦叶片中的AsA含量增加2～4倍；但在刺梨果实中却没有检测到MDAR和DHAR的活性[11]。研究结果表明，在沙棘果实中测得AsA量变少，而AAO、APX活性增高，表明进入果实期后MDHAR与DHAR不断地还原更多的AsA，但AsA的氧化速度大于还原速度，致使果实期中AsA含量减少，说明这两种酶是沙棘后期AsA积累的因素，即它们的作用集中体现在生长后期，且DHAR的作用更明显，但同时也说明这两种酶不是沙棘各部位积累AsA的关键因素。
沙棘幼叶和果实中GalLDH活性与其AsA水平极显著正相关，并与其AsA含量显著正相关，表明GalLDH活性是影响沙棘叶片和果实中抗坏血酸水平和含量的一个主要因素，这与以拟南芥、刺梨和苹果等为试材的研究结果基本一致[11， 19， 20]。
综上所述，沙棘中AsA含量主要受GalLDH活性调节，同时AsA代谢酶AAO、APX也对AsA积累起到了重要作用，而MDAR、DHAR活性对沙棘中AsA积累的作用主要在生长后期。
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