刺五加根的抗炎活性成分研究

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[摘要] 目的 研究刺五加根的抗炎活性成分。 方法 脂多糖（LPS）和干扰素（IFN-γ）诱导的单核巨噬细胞RAW264.7作为细胞炎症模型，考察了刺五加根提取物对一氧化氮（NO）释放抑制活性，利用HPD100大孔吸附树脂、硅胶柱层析、反相色谱柱（ODS）、凝胶色谱、半制备高效液相等色谱技术对其进行化学成分分离，并运用薄层色谱法，红外光谱、核磁等波谱技术确定化合物的结构。 结果 刺五加根提取物具有抑制NO释放活性，从中分离得到7个化合物，分别鉴定为紫丁香苷、刺五加苷B1、刺五加苷E、芝麻素、胡萝卜苷、β-谷甾醇和香草酸。 结论 刺五加根提取物具有抗炎活性，其中的苯丙素类成分为其抗炎活性成分。

[关键词] 刺五加根；化学成分；抗炎活性；一氧化氮

[中图分类号] R961.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）05（a）-0020-04

[Abstract] Objective To study the anti-inflammatory constituents of Acanthopanax senticosus. Methods NO production in the activated RAW 264.7 macrophages induced by LPS and IFN-γ were used to evaluate anti-inflammatory activity. The compounds were isolated by HPD 100 resin， silica gel， ODS and HPLC methods， their structures were identified by Infrared TLC method and spectral imaging spectrum technology. Results The extraction of A. senticosus. had inhibitory activity on NO production. Seven compounds were isolated and identified as Syringin， Isofraxidin-7-O-glucoside， Syringaresinoldi-O-β-D-glycoside， Sesamin， Daucosterol， β-sitosterol and Vanillic acid respectively. Conclusion The extraction of A. senticosus. has the anti-inflammatory effect， and phenylpropanoids are the anti-inflammatory constituents.

[Key words] Acanthopanax senticosus； Constituents； Anti-inflammatory activity； Nitric oxide

刺五加Acanthopanax senticosus（Rupr.et Maxim.）Harms为五加科五加属植物，别名五加皮、刺拐棒；刺五加含有酚苷类、黄酮类、脂肪酸类、多糖类及各种微量元素、氨基酸等化学成分；具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、抗损伤及抗疲劳作用，可治疗心脑血管疾病、糖尿病、神经衰弱、高脂血症、低血症等疾病[1-7]。本研究以脂多糖（LPS）和干扰素（IFN-γ）诱导的单核巨噬细胞RAW264.7作为细胞炎症模型，考察了刺五加根提取物对一氧化氮（NO）释放抑制活性，并从中分离得到7个化合物，经TLC与波谱解析鉴定为紫丁香苷、刺五加苷B1、刺五加苷E、芝麻素、胡萝卜苷、β-谷甾醇和香草酸。

1 仪器与试药

VARIAN 600 MR超导核磁共振波谱仪（TMS为内标，美国VARIAN公司），熔点仪（北京科仪电光仪器厂），酶联免疫检测仪（Model 3550 Microplate Reader，BIO-RAD）。凝胶Sephadex LH-20（美国GE公司），HPD100大孔吸附树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司），ODS（50～70 μm），实验所用试剂规格均为分析纯。RAW264.7小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（ATCC TIB-71）购自上海中国科学院细胞库，脂多糖（美国Sigma公司）、干扰素-γ（美国Genzyme/Techne 公司）。刺五加根购自贵州益佰制药股份有限公司，由苏州大学刘春宇教授鉴定为五加科植物刺五加A.senticosus Harms的干燥根。

2 方法与结果

2.1 NO释放抑制活性测定

RAW 264.7细胞浓度8×104个/mL，每孔100 μL接种于96孔培养板，设立空白对照组、模型对照组、阳性对照组（100、30 μg/mL）及给药组（100、30、10、3 μg/mL），每个浓度设3个复孔，在5%CO2和37℃下培养24 h，加入LPS （终浓度为100 ng/mL），IFN-γ （终浓度为0.33 ng/mL），样品DMSO溶液 （溶解样品的DMSO相对于培养基的含量

2.2 提取分离

称取刺五加根1000 g，8000 mL 60%乙醇回流提取2 h，重复3次，合并提取液，浓缩至浸膏。将浸膏水溶解，滤纸过滤，滤液经HPD100大孔吸附树脂，依次以蒸馏水、20%乙醇、30%乙醇、75%乙醇洗脱。20%乙醇洗脱部位经硅胶柱层析；30%乙醇部分经硅胶柱层析、ODS柱层析、凝胶柱层析；75%乙醇部分经硅胶柱层析、ODS柱层析；最终分离得到7个化合物，化合物1（799 mg）、化合物2（8 mg）、化合物3（41 mg）、化合物4（13 mg）、化合物5（9 mg）、化合物6（10 mg）和化合物7（61 mg）。

2.3 刺五加提取物对巨噬细胞产生NO的影响

刺五加根60%乙醇提取物对LPS和IFN-γ诱导的单核巨噬细胞RAW264.7产生NO的抑制作用呈剂量依赖关系，浓度为100 μg/mL，抑制率达到（59.96±4.57）%，浓度为30 μg/mL，抑制率为（20.02±4.22）%，浓度为10 μg/mL，抑制率为（8.81±5.29）%，浓度为3 μg/mL，（6.36±3.52）%，n=3。阳性对照组浓度为100 μg/mL，抑制率达到（94.73±2.05）%，浓度为30 μg/mL，抑制率为（62.70±5.08）%，n=3。刺五加根60%乙醇提取物在浓度为100 μg/mL时，与30 μg/mL浓度的阳性对照组对NO产生的抑制能力相当。

2.4 化合物结构鉴定

将化合物1～7的波谱数据进行综合分析，并与参考文献、对照品比对，最终确定结构见图1。化合物1～7的性状与主要波谱数据归属如下：

化合物1：白色针晶 （甲醇），mp 190.0～192.0℃。三氯化铁-铁氰化钾显色反应呈阳性，Molish反应呈阳性。1H-NMR（600 MHz， DMSO-d6），δ：6.69（1H，d，J=2.0 Hz，H-3），6.69（1H，d，J=2.0 Hz，H-5），6.44（1H，d，J=15.8 Hz，H-7），6.41（1H，d，J=15.8 Hz，H-8），4.07（2H，m，H-9），4.81（1H，d，J=7.9 Hz，glc-H-1'）， 3.17～3.55（6H，m），δ3.73（6H，s，2×OCH3）。13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6），δ：134.4（C-1），153.25（C-2， 6），105.0（C-3，5），133.1（C-4），129.0（C-7），130.7（C-8），61.4（C-9），103.1（C-1'），74.7（C-2'），77.8（C-3'），70.5（C-4'），77.1（C-5'），62.0（C-6'），56.9 （2×OCH3）。上述波谱数据与文献[9]报道的紫丁香苷数据一致，与紫丁香苷对照品薄层比较，二者的薄层层析行为一致，且与对照品混合熔点不下降，鉴定化合物1为紫丁香苷。

化合物2：无色针晶（甲醇），mp 204.0～205.0℃。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6），δ：7.96（1H，d，J=9.5 Hz，H-4），7.13（1H，s，H-5），6.40（1H，d，J=9.5 Hz，H-3），5.16（1H，d，J=7.0 Hz，glc-H-1'），3.82（3H，s，OCH3），3.91（3H，s，OCH3）。13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6），δ：159.8（C-2），114.7（C-3），144.4（C-4），105.5（C-5），149.4（C-6），141.6（C-7），140.2（C-8），142.4（C-9），114.5（C-10），102.1（C-1'），74.1（C-2'），77.5（C-3'），69.8（C-4'），76.5（C-5'），61.2（C-6'），56.5（OCH3），60.8（OCH3）。上述波谱数据与文献[10]报道的刺五加苷B1数据一致，鉴定化合物2为刺五加苷B1。

化合物3：白色粉末（甲醇），10%H2SO4试剂呈现蓝色，Molish反应呈阳性。1H-NMR （600 MHz，DMSO-d6），δ：6.62（4H，s，H-2'，6'，2''，6''），4.86（2H，d，J = 5.4 Hz，glu-1，glu-1'），4.60（2H，d，J = 4.0 Hz，H-7， 7′），3.11（2H，m，H-8，8'），3.80，4.13（H-9，9'），3.81～4.16（12H，m），3.73（12H，s，4×OCH3）。13C-NMR （125 MHz，DMSO-d6），δ：53.6（C-1，5），85.1（C-2，6），71.3（C-4，8），133.7（C-1'，1''），104.2（C-2'，6'，2''，6''），152.6（C-3'，5'，3''，5''），137.1（C-4'，4''），102.7 （glc-1'，1''），74.2（glc-2'，2''），76.5 （glc-3'，3''），69.9（glc-4'，4''），77.2（glc-5'，5''），60.9 （glc-6'，6''），56.4（4×OCH3）。上述波谱数据与文献[11]报道的刺五加苷E数据一致，与刺五加苷E对照品薄层比较，二者的薄层层析行为一致，且与对照品混合熔点不下降，鉴定化合物3为刺五加苷E。

化合物4：白色粉末（甲醇），Molish反应呈阳性。IR（KBr）：3420，2937，2870，1465，1380，1105，1060 cm-1。与胡萝卜苷对照品薄层比较，二者的薄层层析行为一致，且与对照品混合熔点不下降，鉴定化合物4为胡萝卜苷。

化合物5：白色粉末。将其与β-谷甾醇对照品对照品薄层比较，二者的薄层层析行为一致，且与对照品混合熔点不下降，鉴定化合物5为β-谷甾醇。

化合物6：白色粉末。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6），δ：3.00（2H，m，H-8，8'），3.75（2H，dd，J=9.2，3.3 Hz，H-9a，9'a），4.11（2H，dd，J=8.8，6.6 Hz，H-9e，9e'），4.63（2H，d，J=4.0 Hz，H-7，7'），5.99（4H，s，2×OCH2O），6.92（2H，s，H-2，2'），6.83（2H，d，J=8.1 Hz，H-6，6'），6.87（2H，d，J=7.7 Hz，H-5，5'）。13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6），δ：147.4（C-4，4'），146.5（C-3，3'），135.5（C-1，1'），119.4（C-6，6'），108.0（C-5，5'），106.6 （C-2，2'），84.9（C-7，7'），71.0（C-9，9'），53.7（C-8，8'），100.9（2×OCH2O）。上述波谱数据与文献[12]报道的芝麻素数据一致，鉴定化合物6为芝麻素。

化合物7：白色晶体（甲醇），mp 63.0～64℃。1H-NMR （600MHz，DMSO-d6），δ：6.82（1H，d，J=8.1 Hz， H-5），7.42（1H，m，H-2，6），3.78（3H，s，OCH3），δ 9.86 （1H，s，OH）。13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6），δ：167.2（-COOH），151.0（C-4），147.1（C-3），123.4（C-6），121.5（C-1），114.9（C-2），112.6（C-5），55.5（OCH3）。上述波谱数据与文献[13]报道的香草酸数据一致，鉴定化合物7为香草酸。

3 讨论

NO是从血管内皮发现的小分子，一氧化氮合酶（NOS）催化L-精氨酸产生的5个电子的氧化物；NO 既兼有第二信使和神经递质的功能，又是效应分子，介导和调节多种生理和病理过程；急慢性炎症的发生均与NO 有关系，抑制NO 的生成被认定为治疗炎症疾病比较有前景的方法[14]。文献报道，刺五加水提物具有抗炎作用，可能通过抑制活化的巨噬细胞产生炎症介质发挥其抗炎功效[15]。巨噬细胞中含有诱导型NOS，在LPS、IFN-γ等刺激下诱导表达可以催化精氨酸产生NO。因此，采用LPS和IFN-γ诱导的单核巨噬细胞RAW264.7作为细胞炎症模型，考察刺五加醇提物对单核巨噬细胞RAW264.7产生NO的影响。实验结果表明，刺五加根的醇提物对LPS和IFN-γ诱导的单核巨噬细胞RAW264.7产生NO具有抑制作用，从中分离得到紫丁香苷、刺五加苷B1、刺五加苷E、芝麻素等苯丙素类成分。文献报道，芝麻素等苯丙素类成分具有抑制NO生成和抗炎的作用，此类化合物在抗感染、抗心血管疾病等方面具有显著的活性[16]，与刺五加的功效、临床应用[1-7]比较一致。因此，此类化合物可能是刺五加的抗炎药效成分之一，对此类化合物的深入研究将有助于人类更深入地理解刺五加的药效物质基础。

中药抗炎药理研究已从“整体-器官-细胞”水平发展到在分子、细胞水平探讨中药的作用机制；中药有多种抗炎作用机制，如对下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴（HPAA）的影响，导致内源性皮质醇分泌增多而发挥抗炎效应[17]；干扰花生四烯酸代谢，苦参碱对磷脂酶A2（PLA2）活性的抑制是其抗炎机制之一[18]；对细胞因子的影响，银杏叶提取物通过下调IL-13 的表达，从而使气道炎细胞浸润减少，减轻气道炎症[19]；对核因子的影响，氧化苦参碱可抑制NF-κB活化，降低TNF-α和IL-6的生成， 从而减轻葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎炎性损伤[20]；抗组胺、5-羟色胺、NO等炎症介质的作用，银杏叶总黄酮能明显降低大鼠足爪局部炎症组织中NO的含量，提示其抗炎机制与抑制NO生成有关[21]。本次实验中，刺五加提取物能抑制LPS和IFN-γ诱导的单核巨噬细胞RAW264.7的NO产生，这可能是刺五加抗炎作用机制之一；刺五加含有多种化学成分，不同成分的药理作用及作用靶点不同，下一步，可以从炎症动物模型验证刺五加的抗炎作用，从细胞因子、核因子等方面多角度探索刺五加的抗炎作用机制。

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（收稿日期：2016-01-21 本文编辑：赵鲁枫）