亮甲酚蓝优选哺乳动物卵母细胞技术研究进展

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摘要 随着动物胚胎工程技术的不断发展，卵母细胞的需求量不断增大。卵母细胞的质量决定植入前早期胚胎发育的效率，为此筛选出优质卵母细胞对于提高后续胚胎的发育起着决定性的作用。本文就亮甲酚蓝染色筛选成熟培养前的卵母细胞，对于卵母细胞质量、后续胚胎发育效率和早期胚胎发育相关基因表达的影响方面的研究予以综述，期望对于同行有一定的借鉴意义。

关键词 亮甲酚蓝；卵母细胞；胚胎发育；胞质成熟

中图分类号 S813.3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）08-0238-01

Abstract With the continuous development of animal embryo engineering and technology，the demand of oocytes is increasing a lot.Oocyte quality can affect the efficiency of early embryonic development，so it plays a decisive role for subsequent embryonic development through selecting high-quality oocytes.In this paper，the effects of Brilliant Cresol Blue staining（BCB）on further embryo development were reviewed，which included the quality and efficiency of subsequent embryonic development and the influence of gene expression of early embryo.It was expected that it would be helpful for their peers in the early embryo development research fields.

Key words brilliant cresyl blue（BCB）；oocyte；embryo development；cytoplast maturation

生长期的卵母细胞代谢旺盛，含有大量的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH），但是随着卵母细胞的生长期结束其活性也逐渐降低直至消失，因此卵母细胞成熟时G6PDH的含量很少。卵母细胞经过采用亮甲酚蓝（BCB）染色，由于G6PDH可以使BCB由原来的蓝色变成无色，因此可以分辨出生长期的卵母细胞和成熟的卵母细胞，前者表现为胞质未着色（BCB-），而后者则胞质呈蓝色（BCB+）。因此，BCB染色技术已经被广泛用于多种动物卵母细胞的筛选，并取得了很好的效果[1-4]。此外，已有的研究认为，处于生长阶段的卵母细胞的发育能力远低于成熟期的卵母细胞，因此通过BCB染色技术还能够间接的评估卵母细胞的质量。通过采用BCB对成熟培养前的猪[1- 2]、山羊[3]、绵羊[5]和牛[6-7]卵母细胞染色用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶间接评价优选卵母细胞，为后续研究提供优质卵母细胞。有研究发现未着色的卵母细胞培养成熟后，用于核移植具有更高的体外囊胚发育率[8- 9]。在动物胚胎生产中，主要从屠宰场采集卵巢，由于挑选的卵母细胞来自不同生长阶段的卵泡，导致了卵母细胞质量存在差异。

本文就BCB在筛选成熟培养前的卵母细胞后，对于卵母细胞质量、后续胚胎发育效率和早期胚胎发育相关基因表达的影响方面的研究予以综述，期望对于动物胚胎工程研究领域的同行有一定的借鉴意义。

1 BCB筛选卵母细胞质量的研究

在BCB筛选小鼠卵母细胞的研究方面，有研究发现[10]，BCB+ 组的卵母细胞染色体周围核仁的数量较多，并且其胞质成熟较充分（通过GSH水平和线粒体的分布方式），成熟后期具有较好的发育潜力。这个结论已经在很多动物中卵母细胞筛选中得到证实，概述如下。

（1）在BCB筛选牛卵母细胞的研究方面，有研究发现：用26、39、52 μmol/L的亮甲酚蓝染色后所得到的BCB+组（27.7%、27.6%、31.9%），较13 μmol/L的亮甲酚蓝染色后所得到的BCB+ 组（2.1%）差异显著，而且其BCB染色后，BCB+组的体外成熟率（77.4%）显著高于BCB- 组（51.3%）和对照组（60.2%）[11]。

（2）在BCB筛选猪卵母细胞的研究方面，有研究发现：BCB+ 组卵母细胞的核成熟率（80.8%）显著高于BCB- 组（44.2%）和空白对照组（72.4%）[12]。此外，在通过BCB染色提高猪体外胚胎培养体系的效率的研究中发现[13]：BCB+ 组的猪卵母细胞的91.16%已经达到减数分裂Ⅱ期，显著高于BCB-组（64.10%）和对照组（77.15%）。

（3）在BCB筛选山羊卵母细胞的研究方面，有研究发现：BCB+ 和BCB- 组的卵母细胞的平均直径分别为136.6、125.5 μm，可见BCB+ 组的卵母细胞显著长于BCB- 组（P

由此可见，以亮甲酚蓝染色为基础的哺乳动物卵丘―卵母细胞复合体的区分可以用来有效地选择更具发育活力的卵母细胞，为后续转基因动物的研究奠定基础。

2 BCB筛选后早期胚胎发育效率的研究

在研究BCB对于牛卵母细胞选择后胚胎进一步的发育发现，胞质染蓝色的牛体外受精胚胎的囊胚率达到32.99%，而对照组和无色组分别为17.64%和3.57%；同时进一步进行核移植研究发现，在用BCBG筛选的卵母细胞进行核移植研究发现[15]：BCB+ 组不仅可以获得较高的核移植囊胚率，而且其囊胚细胞总数也显著高于对照组、控制对照组和BCB- 组[16]。有研究发现，经过BCB筛选能够显著降低牛卵母细胞后续的胚胎发育细胞凋亡率，BCB+ 组、对照组和BCB- 组的凋亡率分别为6.50%、28.21%、39.06%。最近的研究发现，BCB+ 组的孤雌囊胚形成率达到32.9%，而BCB- 组的孤雌囊胚形成率仅为10.1%；BCB+ 组显微操作核移植胚胎的囊胚发育率（14.1%）显著高于BCB- 组（3.4%），但与对照组之间无显著差异；各组手工克隆胚胎发育率之间无显著差异[12]。有研究发现，BCB+ 组、对照和BCB- 组孤雌猪胚胎的囊胚率分别为34.19%、23.11%和9.15%，BCB+ 组比BCB- 组显著高25.04%；BCB+核移植猪胚胎的囊胚率可以达到23.10%，而BCB- 组的囊胚率仅有5.10%。通过对BCB染色的猪卵母细胞的孤雌胚胎和核移植胚胎发育情况的统计分析发现，BCB+组孤雌囊胚率和核移植囊胚率分别为34.28%和23.74%，显著高于BCB- 组（12.25%和6.28%）和对照组（26.52%和17.05%），并且BCB+ 组具有较多的囊胚细胞[17]。

综上可见，以亮甲酚蓝染色为基础的卵丘―卵母细胞复合体的区分可以用来有效地选择更具发育活力的卵母细胞，其后续构建的胚胎具有更大的发育潜力。因此，亮甲酚蓝可用于卵母细胞染色的选择，并作为判断卵母细胞质量的一个重要标记。

3 BCB筛选后早期胚胎相关基因表达的研究

最近的研究发现，BCB+ 组卵母细胞的胞质成熟对于受精后正常的胚胎发育是至关重要的，亮甲酚蓝染色液（BCB）能有效筛选出胞质成熟卵母细胞[18]。为进一步了解经过 BCB 筛选的卵母细胞中母源基因mRNA表达量的差异性，进而更为准确地评价BCB对卵母细胞筛选的可行性和可靠性，判断母源基因与卵母细胞的胞质成熟的相关性，为深入了解哺乳动物卵母细胞成熟和早期胚胎发育提供技术手段。经过 BCB筛选后对于不同类卵母细胞的母源性物质表达差异研究表明，4种母源基因（Gdf9、Mater、Zar1和Dnmt1）在BCB+卵母细胞中的表达量显著低于BCB- （P

综上所述，亮甲酚蓝染色筛选成熟培养前的卵母细胞，可以作为获取优质卵母细胞的一个有效方法，为后续重构胚胎提供优质的卵母细胞，从而提高其胚胎的发育效率。但是有关BCB筛选卵母细胞后，胚胎后续发育过程中有关对于表观遗传以及涉及的子代安全性的问题还未见研究性报道，所以需要进一步对亮甲酚蓝筛选优质卵母细胞的方法进行验证，确保该筛选优质卵母细胞方法的可行性。

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