中药材锁阳的ITS2条形码分子鉴定研究
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[摘要] 目的：应用DNA条形码技术准确、快速鉴定中药材锁阳及其混伪品。方法：采用试剂盒法提取药材的基因组DNA，PCR扩增其核糖体DNA的内转录间隔区（internal transcribed spacer 2， its2）并进行双向测序，应用CodonCode Aligner V 3.7.1对测序峰图进行校对拼接，比较ITS2序列的GC含量，采用MEGA 5.0计算种内、种间 Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离，通过中药材DNA条形码鉴定系统比对和构建NJ 系统聚类树进行鉴定分析。结果：锁阳药材的ITS2序列长度为229 bp，种内变异较小，平均K2P遗传距离为0.003，锁阳药材及其混伪品的种间平均K2P遗传距离为0.760，种间最小K2P遗传距离明显大于锁阳种内的最大K2P遗传距离。中药材DNA条形码鉴定系统比对和NJ树鉴定结果均表明ITS2 序列可区分锁阳及其混伪品。结论：ITS2条形码可有效鉴定中药材锁阳及其混伪品，且具有较好的稳定性和准确性，为保障临床安全用药提供了新的技术手段。
中药材锁阳Cynomorii Herba为锁阳科Cynomoriaceae植物锁阳Cynomorium songaricum Rupr.的干燥肉质茎。具有补肾阳，益精血，润肠通便之功效。用于肾阳不足，精血亏虚，肠燥便秘等[1]，是藏族、蒙古族和维吾尔族等民族的特有药材[2]。研究表明，锁阳在防癌、抗肿瘤、提高机体免疫力、抑制人体免疫缺陷病毒（HIV）等方面也有重要作用[3-4]。在我国，锁阳以野生为主，主要分布在宁夏、新疆、甘肃、青海、内蒙古等西北地区[5]。近年来，由于锁阳价格不断攀升，药材市场上出现地黄Rehmannine Radix、湖北地黄Rehmannia henryi N. E. Brown、裂叶地黄R. piasezkii Maxim等混伪品[6]，另外，锁阳又常被做为肉苁蓉Cistanches Herba的伪品使用[7]，严重影响了用药安全。目前已采用性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱等技术对锁阳及其混伪品进行了鉴别[8-9]。然而，传统的鉴定方法需要较高的专业水平和丰富的经验，为保障药材质量，确保临床用药安全有效，亟待应用快速有效的方法对锁阳及其混伪品进行鉴定。
DNA条形码（DNA barcoding）技术以稳定的基因组信息为依据，有望实现对物种鉴定的标准化[10-11]。2010年，Chen等[12]首次提出把ITS2作为药用植物鉴定的标准DNA条形码。Yao等[13]提出ITS2序列可作为植物物种鉴定的通用条形码。Song等对ITS2序列的鉴定机制进行了初步研究[14]。目前，ITS2序列已在多种药用植物及药材的鉴定中得到了应用[15-20]。本研究应用ITS2 序列对药材锁阳及其混伪品进行鉴定研究，为锁阳药材的快速准确鉴定提供保障，也为临床用药安全奠定基础。
1材料
本研究所用材料共7个物种31个样品，包括试验样品及GenBank下载序列。其中，锁阳药材样品11个，地黄药材样品6个，湖北地黄样品2个，裂叶地黄样品2个，肉苁蓉C. deserticola Ma样品3个，管花肉苁蓉C. tubulosa（Schenk）Wight 样品4个，沙苁蓉C. sinensis G. Beck样品3个。所有材料经中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员鉴定， 凭证样品保存于中国医学科学院药用植物研究所。实验材料及序列的GenBank登录号见表1。
2方法
2.1DNA提取 锁阳药材用75%乙醇擦拭表面后，取约30 mg加入3%的PVP-40（聚乙烯吡咯烷酮），用DNA 提取研磨仪（Retsch MM400， Germany）研磨2 min（30次/s）后，用植物基因组DNA提取试剂盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取总DNA，56 ℃ 水浴过夜，其余步骤按照试剂盒说明进行。
2.2PCR扩增及测序 ITS2 序列扩增用正向引物为5′- ATGCGATACTTGGTGTGAAT -3′，反向引物为5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′[12]。PCR反应体积为25 μL，包括2×Easy Taq PCR SuperMix（TransGen Biotech Co.， China）12.5 μL，2.5 μmol・L-1引物各1 μL、模板DNA约50 ng，ddH2O补足至25 μL。PCR扩增程序为：94 ℃变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40个循环；72 ℃ 延伸10 min。PCR产物经纯化后，使用ABI 3730XL（ Applied Biosystems Co.，USA）测序仪进行双向测序。
2.3数据处理 测序峰图利用CodonCode Aligner V3.7.1（CodonCode Co.， USA）校对拼接， 去除低质量序列及引物区，获得 ITS2 序列。利用软件MEGA5.0（molecular evolutionary genetics analysis）分析比对[21]， 并基于Kimura 2-parameter（K2P）模型进行种内种间遗传距离分析， 用邻接（NJ）法构建系统聚类树， 利用bootstrap（1 000次重复）检验各分支的支持率。登录中药材DNA条形码鉴定系统（http：///）进行序列相似性搜索（BLAST） [22]。利用BLAST比对和NJ树对锁阳、地黄和肉苁蓉药材及其同属近缘种进行鉴定分析。
3结果
3.1锁阳药材基因组DNA提取及PCR扩增 提取的锁阳药材基因组DNA电泳检测显示条带呈弥散状态，说明DNA降解严重。NanoDrop检测结果表明，所有锁阳药材基因组DNA的A260/A280均在1.6～1.8，仅有2个样品的A260/A230小于2.0，有少量糖类物质的污染，但所有样品的DNA 浓度都大于10 mg・L-1。所有样品的PCR电泳结果均显示较亮条带，说明无论DNA的降解或糖类及蛋白质的污染都没有影响锁阳药材ITS2序列的PCR扩增。
3.2锁阳药材及其混伪品的ITS2 序列分析 本研究中11个锁阳药材的 ITS2 序列长度均为229 bp， GC 量为48.0%，序列变异较小，仅存在2个变异位点，分为3个单倍型，单倍型A1序列全部与KC463817相同，单倍型A2的序列全部与KC463820相同，KC463823为单倍型A3。基于K2P模型的遗传距离分析表明，锁阳种内变异较小，其K2P遗传距离为0～0.009，平均K2P遗传距离为0.003。31份样本的种间变异较大，平均K2P遗传距离为0.760，其中地黄与肉苁蓉种间的K2P遗传距离为0.032～0.353，锁阳与地黄及肉苁蓉的种间K2P遗传距离为1.076～1.267。所有样本的种间最小遗传距离明显大于锁阳的种内最大遗传距离。各样本的ITS2 序列长度、GC量、单倍型及GenBank登录号见表1。
3.3锁阳药材及其混伪品的ITS2序列鉴定 利用中药材DNA条形码鉴定系统对锁阳及其混伪品的ITS2序列进行比对，结果表明ITS2 序列可以准确区分锁阳、地黄、肉苁蓉及其混伪品。基于ITS2 序列构建的NJ 系统聚类树见图1，结果显示，锁阳单独聚为一支，地黄及其近缘种湖北地黄、裂叶地黄分别聚为一支，肉苁蓉与其同属的管花肉苁蓉和沙苁蓉也分别聚在一起，均表现出良好的单系性，NJ树可明确区分锁阳及其混伪品。因此，ITS2序列作为条形码可快速准确鉴别锁阳及其混伪品。4讨论
分子生物学鉴定是应用DNA分子标记技术鉴定中药原植物及其药材和饮片的方法，在物种鉴定方面表现出了独特优势，如RFLP（restriction fragment length polymorphism）技术、RAPD（random amplified polymorphism DNA），SSR（simple sequence repeat）技术等弥补和克服了传统鉴定方法的诸多缺陷，得到了广泛的应用，但这些分子标记技术往往表现出通用性低，可重复性不强的特点[23]。与其他分子鉴定方法相比，DNA条形码技术具有明显优势，供试材料可以不受发育阶段、环境条件、存在形态等影响；鉴定过程更加趋于标准化，操作简单等，在中药鉴定领域中展示了广阔的应用前景[11]。而且随着DNA条形码技术的逐步发展，研究者又提出了叶绿体超级条形码的概念，并得到了初步应用[24]。锁阳应用历史悠久，是我国重要的民族中药，近年来，随着其用量的逐渐增多，市场上混伪品时有出现，为了确保临床用药安全，本研究采用DNA条形码技术对中药材锁阳及其常见混伪品进行鉴定研究。结果表明ITS2条形码序列可有效鉴别锁阳药材及其混伪品，为锁阳药材鉴定的标准化奠定了基础，具有重要的应用和参考价值。
直接从药用植物叶片中提取基因组DNA的方法已相对成熟[10]，而药材DNA的提取仍然需要探索，能否获得药材的基因组DNA是中药材DNA条形码技术研究的前提和基础，也是该技术在药材鉴定领域推广应用的必要条件[18，25]。为了获得锁阳药材的基因组DNA，本研究对常用的试剂盒法进行了如下改良：PVP是酚类物质的络合物，可以与多酚结合形成不溶的络合物，有效去除多酚，同时它还可以和多糖结合，去除多糖，进而减少DNA中酚类和糖类物质的污染。经过摸索，本研究中加入3%的PVP-40，可以显著提高锁阳药材DNA的提取效果；为了获得尽可能多的DNA，本研究采用56 ℃水浴过夜，使细胞裂解液充分裂解，可有效提高DNA提取的成功率。另外，植物和真菌中广泛存在ITS2片段，如药材表面有真菌污染，PCR扩增产物就有可能是真菌的ITS2片段，从而影响实验结果。锁阳药材多成块状，硬度较大，而且表面经常伴有杂质，为避免PCR扩增过程中真菌的污染，首先用75%乙醇仔细擦洗其表面并刮去外皮，然后再用刀片刮取其内部组织供提DNA用。结果显示，本研究获得的ITS2序列不存在真菌ITS2序列的干扰，有效提高了利用DNA条形码技术鉴定锁阳药材的稳定性和准确性。
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Molecular identification of Cynomorii Herba using ITS2 DNA barcoding
HOU Dian-yun1，2， SONG Jing-yuan2， SHI Lin-chun2， YANG Pei2， CHEN Shi-lin2，3， YAO Hui2*
（1.Agricultural College， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003， China；
2.The National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials，
Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，
Beijing 100193， China；
3.Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）
[Abstract] Objective： To identify the Cynomorii Herba and its analogues species using DNA barcoding technique. Method： Total genomic DNA extracted from all materials using the DNA extraction kit. The internal transcribed spacer 2（ITS2） regions were amplified using polymerase chain reaction （PCR）， and purified PCR products were sequenced bi-directionally. Sequence assembly and consensus sequence generation were performed using the CodonCode Aligner 3.7.1. The Kimura 2-Parameter （K2P） distances and GC content were computed using MEGA 5. 0. Species identification analyses were conducted through the species identification system for traditional Chinese medicine and neighbor-joining （NJ） trees. Result： The ITS2 sequence lengths of Cynomorii Herba were 229 bp. The average intra-specific genetic distances of Cynomorii Herba were 0.003. The average inter-specific genetic distances between Cynomorii Herba and its adulterants species were 0.760. The results showed that the minimum inter-specific divergence is larger than the maximum intra-specific divergence. The species identification system for traditional Chinese medicine and NJ trees results indicated that Cynomorii Herba and its adulterants species can be easily identification. Conclusion： The ITS2 region is an efficient barcode for identification of Cynomorii Herba，which provide a new technique to ensure clinical safety in utilization of traditional Chinese medicine.
[Key words] Cynomor II Herba； DNA barcoding； ITS2； molecular identification
doi：10.4268/cjcmm20132307