3型肺炎球菌多糖抗原口服给药途径的效力研究
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摘要:[目的]分析3型肺炎球菌多糖抗原口服给药途径的有效性。[方法]用注射器对小鼠灌喂3型肺炎球菌多糖抗原，33 d后检测小鼠NK杀伤细胞活性和抗体形成细胞数，并进行统计学分析。[结果]3型肺炎球菌多糖抗原口服前后小鼠NK杀伤细胞活性和抗体形成细胞数差异有统计学意义(P＜0.05)，与同类产品比较差异无统计学意义(P＞0.05)。[结论]3型肺炎球菌抗原能显著提高小鼠NK杀伤细胞活性和抗体形成细胞数。
关键词: 3型肺炎球菌多糖抗原;口服; 效力
中图分类号: R 186 文献标识码:A
反复耳鼻喉､呼吸道感染对儿童是一种较严重的健康问题，同时也会导致缺课以致影响学习。尽管抗生素和其他药物常可使急性感染缓解，但却常难以预防复发。而且抗生素多有不良反应。对反复呼吸道､耳鼻喉感染，口服免疫疗法可能是更合理的手段。
大部分欧洲国家预防反复性上呼吸道感染的方法包括使用从细菌中提取的混合物类的免疫增强药物[1]，如泛福舒(Broncho-Vaxom或者OM-85 BV)，其是通过逐步碱溶解提取的8种细菌混合物(肺炎双球菌､肺炎克雷伯杆菌､流感嗜血杆菌､臭鼻克雷伯菌､金黄色葡萄球菌､化脓性链球菌､草绿色链球菌､卡他奈瑟菌)，最后通过澄清过滤制成成品。对116名6个月~19岁的孩子口腔给药，连续10 d，疗程3个月。随机双盲试验表明39%未发生感染，而安慰剂组只有16%。
法国赫美罗(Hoechst)公司生产的必思添(Biostim)是一种从肺炎克雷伯杆菌中提取的糖蛋白RU41.740，它已在临床中显示对易患反复呼吸道感染的病人减少其感染的作用，同时也在动物实验中证明可以减少感染了多种细菌的动物的死亡率。它主要是激活B细胞､T细胞和巨噬细胞。
我们通过自然杀伤细胞(NK)试验和抗体形成细胞(PFC)检测，研究本试验室从3型肺炎球菌中提取的抗原与同类产品在小鼠体内能否激发相似的免疫反应。
1材料与方法
1.1实验方法
1.1.1抗原提取3型肺炎链球菌糖蛋白通过细菌培养后杀菌，用乙醇分段沉淀法提取抗原。用Lorry法检测蛋白含量，用分光光度法检测核酸含量，用蒽酮法检测多糖总量。用肺炎球菌特异性抗血清，通过琼脂双扩试验对肺炎球菌溶菌物的抗原性进行特异性鉴定。
1.1.2免疫程序用注射器对小鼠进行灌喂，每次0.4 mL，于1､2､3､4､5､19､20 d喂药，33 d时进行实验。
1.1.3NK细胞活性检测实验效应细胞(EC)采用小鼠脾细胞，靶细胞(TC)采用Yack-1细胞。检测方法见参考文献[2]。
1.1.4溶血空白试验溶血空斑试验(plaque forming cell assay，PFC)是Jerne于1963年设计的，用于体外检查和计数某种抗体形成细胞。该方法将致敏羊红细胞(SRBC)免疫动物，随后取其脾制成淋巴细胞悬液与高浓度的SRBC混合后加入琼脂凝胶中，其中每个释放溶血性抗体的细胞可致敏其周围的SRBC，当加入补体时，致敏的SRBC被溶解而形成了局部的溶血空斑，每一个空斑代表一个抗体形成细胞。本实验采用玻片法[3]。
1.2统计学方法
用方差分析进行统计学计算。
2结果
2.1生化及血清学检测结果
3型肺炎多糖的蛋白含量为20.49%，多糖含量为17.72%，核酸含量为7.16%。
肺炎球菌3型多糖与对应血清的琼脂双向扩散试验结果显示，3型肺炎球菌多糖提取物与抗血清产生了明显沉淀线，保持了其抗原性(图1)。
3型肺炎球菌多糖抗原
16 中间:血清
251､3､5:3型肺炎球菌多糖
342､4､6:生理盐水
图13型肺炎球菌多糖鉴别试验结果
2.2免疫学检定结果
NK细胞活性实验的结果见表1。3型肺炎球菌多糖抗原和泛福舒均可激活小鼠体内NK细胞活性。
方差分析， 肺炎多糖组､泛福舒组与对照组相比，P值均
提取的抗原与阳性对照药物(泛福舒)有相似的免疫特性(P＞0.05)，并且出现了比未灌喂药物组的溶血空斑数显著增加(P＜0.05)。试验抗原能显著提高小鼠抗体形成细胞数(表2)。
3讨论
细菌裂解物作为口服抗原，在国外用于治疗慢性呼吸道疾病已经有很长一段时间，效果显著。
我们对所提取的3型肺炎球菌多糖抗原进行了生化测定，主要包括多糖含量､蛋白含量
及核酸含量。并用特异性抗血清作了鉴别试验，证明了提取物仍保持了抗原性。同时通过对小鼠口服给药，研究了3型肺炎球菌菌溶物的免疫学特性。结果表明，提取的3型肺炎球菌多糖抗原与阳性对照药物(泛福舒)在自然杀伤细胞(NK)试验和抗体形成细胞(PFC)检测中显示出相似的免疫特性，能显著提高小鼠NK杀伤细胞活性和抗体形成细胞数。
4参考文献
[1]Revillard JP，Conzon G，Czerkinsky C.Oral administration of immunomodulators and the mucosal immune system[M].In:Brown F， Revillard JP，eds.Biological standardization:standardization of the immunopharmacology of natural and synthetic immunomodulators.Basel:Karger，1992:31-40.
[2]Nakajinma H，Park H，Henkart PA.Synergistic role of granzyme A and B in mediating target cell death by RBL mast cell tumors also expressing cytolysin/perforin[J].J Exp Med，1995，181:1037.
[3]Tauris P ，Peterslund N A， Black F T， et al. Evaluation of the acyclovir-induced modulation of the plaque-forming cell response of human peripheral blood lymphocytes[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy， 1984， 13: 71-77.