微囊化成骨细胞诱导骨髓间充质干细胞体外成骨分化的量效研究
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[摘要] 目的 探讨微囊化成骨细胞体系细胞添加量对诱导骨髓间充质干细胞体外成骨分化的影响。 方法 制备含有成骨细胞的海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠微囊，与间充质干细胞的共培养，在1，7，14 d通过细胞增殖量、碱性磷酸酶活性、实时定量PCR等检测，统计结果并分析。 结果 各时段细胞增量无统计学意义；碱性磷酸酶活性随细胞浓度增加表现出递增趋势，且骨钙蛋白mRNA的表达结果基本一致。 结论 微囊化成骨细胞在低浓度下已能促进骨髓间充质干细胞成骨分化，浓度升高时促分化能力越强，但达到一定浓度后继续提高时，对成骨分化的作用则不再增强。
[关键词] 微囊；成骨细胞；骨髓基质干细胞；分化
[中图分类号] R73 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）15-0004-01
骨缺损和骨折不愈合是骨科医生常面临的困难，骨组织工程为解决这一问题带来了希望。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal cells，BMSCs）作为骨组织工程的种子细胞已获得了广泛的认同[1]。骨髓间充质干细胞是一种具有多方向分化潜能的干细胞[2]，目前的研究表明BMSCs能够分化为成骨细胞、神经细胞、脂肪细胞等，不表达共刺激抗原，是一种理想的种子细胞，可以修复受损的人体组织，在组织工程和整形外科等领域具有重要的研究价值[3]。由于人体组织器官结构功能的复杂性，干细胞在植入人体前应进行体外诱导分化，从而降低临床应用的危险性[4]。基于上述前提，我们设计了以下的实验研究。
1 材料与方法
1.1成骨细胞分离培养和鉴定
新生SD大鼠处死后，在无菌条件下，取颅盖骨，去除软组织，将骨块剪成1～2 mm2大小后PBS溶液反复洗涤，离心（1 000 r/min，5 min），弃上清液，加入5 mL胰蛋白酶溶液（浓度为0.25%），37℃ 15 min水浴振荡消化后加入10 mL含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，离心（1 000 r/min，5 min），弃上清液，加入3 mL Ⅱ型胶原酶溶液（浓度1 mg/mL），在37℃水浴消化90 min，离心后除去上清液。加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液后，用吸管轻轻打散细胞沉淀，制成细胞悬液，接种于25 cm2培养瓶内于37°C，5%体积分数CO2环境中培养。48 h全量换液继续培养，每3天换1次液，待细胞融合到80%时，吸去培养基，用PBS冲洗2次后用1 mL含有0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的消化液消化，加入培养液终止消化，离心加培养液重悬之后，采用差速贴壁法筛选获取纯化的成骨细胞原代。待细胞集落呈70%～80%汇合时开始传代，传代3次后进行碱性磷酸酶染色鉴定。
1.2 骨髓间充质干细胞的分离、培养以及免疫表型、成骨分化潜能的鉴定
采用全骨髓贴壁法分离BMSCs：SD大鼠麻醉后常规消毒，备皮，左侧股骨大转子处作骨髓穿刺术。抽取3 mL左右骨髓置于离心管，PBS冲洗，离心（1000转/10 min）后弃上清和脂肪，洗涤2次后加入含有标准培养基的培养瓶中，37°C，5%体积分数CO2环境中培养。48 h后换液，以PBS洗涤2次，换上新鲜培养基，继续培养。每3天换液一次，待到细胞集落呈70%～80%汇合时，开始传代。
BMSCs的成骨分化潜能的鉴定：取第3代BMSCs接种于放有细胞爬片的6孔培养板，细胞覆盖达80%，弃去普通培养液，加入含成骨细胞诱导剂的培养液，每3天换液一次，培养2周。成骨细胞诱导剂含β-甘油磷酸钠10 mM，地塞米松10-9 M，抗坏血酸钠0.2 mM，FBS。经成骨诱导培养2周后取出细胞爬片进行碱性磷酸酶染色鉴定。
1.3 微囊化成骨细胞（OB-APA微囊）的制备和培养以及形态学观察
1.3.1 微囊化成骨细胞的制备和培养 静电液滴发生法制备OB-APA微囊：将成骨细胞与15 g/L的海藻酸钠溶液以体积比1∶10混合均匀，吸入20 mL注射器，在最优制备条件下混入0.1 mol/L CaCl2，海藻酸钙微球，静置10 min后除去上清液，生理盐水洗涤3次，将胶珠投入0.5%聚左赖氨酸震荡条件下反应5 min，生理盐水洗涤3次，再用1.5 g/L的海藻酸钠溶液振荡5 min，除去上清液并用生理盐水洗涤3次，再投入55 mmol/L柠檬酸钠液化5 min，生理盐水洗涤，即得OB-APA微囊[5]。
1.3.2 微囊化成骨细胞计数 采用机械破囊计数法测定制备的OB-APA微囊中的成骨细胞的量，即采用1 mL无菌注射器，内径约为330 nm 的3号针头反复抽吸微囊悬液，使微囊破碎。显微镜下观察以确定细胞已完全释放，然后采用200目筛网过滤微囊碎片，离心，重悬细胞，使用细胞计数板计数。
1.3.3 微囊化成骨细胞形态学观察及形态学观察 制得的微囊化成骨细胞置于培养皿内，使其分散均匀，倒置显微镜下观察其形态。
1.4 实验分组及设计
将第3代BMSCs 接种于放有爬片的培养皿中，细胞密度为5×106 cells/cm2的密度，加入微囊化成骨细胞，及10%胎牛血清的DMEM培养液。根据成骨细胞与骨髓基质干细胞的添加量的比值进行分组。A组：15∶1；B组：10∶1；C组：5∶1；D组：1∶1。
1.5 共培养后BMSCs向成骨细胞定向分化的生物学检测
1.5.1 通过测定DNA含量变化分析BMSCs增殖情况 培养的1、7和14 d，每组取出3个样本，PBS液冲洗后0℃下在含有EDTA和巯基乙醇的细胞裂解液中消化30 min。得上清液，超声仪高频声波裂解，4℃离心（12 000转/5 min）。取40 μL的细胞裂解上清液与160 μL的Hoechst 33258染液混合（1 μg/mL）通过稀释1 mg/mL的牛胸腺DNA获得标准曲线，对比标准曲线测得DNA的含量，并通过荧光计测量每个样品的荧光强度。
1.5.2 碱性磷酸酶活力检测 在共培养的第1、7和14天，每组取出3个样本，PBS液冲洗后，0℃下在含有EDTA和巯基乙醇的细胞裂解液中消化30 min。离心，得上清液，超声仪高频声波裂解，4℃离心（12 000转/5 min）。取100 μL上清液并与400 μL的P-硝基苯磷酸混合，37℃下孵育15 min后50 μL NaOH终止反应。紫外分光光度计在450 nm波长下测定吸光度。
1.5.3 实时定量PCR 骨钙蛋白是检测成骨细胞成熟分化的标志物。各实验组分别在培养第1、7和14天进行RT-PCR检测。引物序列如下。
1.6 统计学分析采用IBM SPSS17.0软件，对各组数据进行t检验及方差分析。P
2 结果
2.1 成骨细胞和骨髓基质干细胞的生长情况及ALP染色倒置显微镜下观察BMSCs呈梭形和纺锤形；OB呈卵圆形，培养瓶中可见典型的铺路石样。倒置显微镜下可见骨髓基质干细胞成骨分化能力良好。
2.2 OB-APA的形态学观察
倒置显微镜下观察到微囊完整性好，不粘连，表面光滑，微球粒径分布也较为均匀。
2.3 BMSCs的增殖情况检测
各试验组在各个时间点的细胞增殖量基本相同，差异无统计学意义（P > 0.05）。
2.4 BMSCs的分化情况检测
2.4.1 ALP活性检测结果 在两种细胞共培养的第1天，各实验组的碱性磷酸酶基本没有区别（P > 0.05）；在共培养第7天和第14天，A组与B组细胞的碱性磷酸酶活性较C组与D组高（P < 0.01，P < 0.05），C组的碱性磷酸酶活性较D组高（P < 0.05），且在第7天和第14天，A组与B组的碱性磷酸酶活性无统计学意义（P > 0.05）。
2.4.2 RT-PCR检测Osteocalcin（OCN） mRNA的表达 骨钙蛋白是成骨细胞的表型之一，且被认为是成骨细胞成熟分化的重要标志。在两种细胞共培养的第1天，各实验组的OCN mRNA的表达情况没有统计学意义（P > 0.05）；在共培养7 d后，A组与B组细胞的OCN mRNA的表达情况较C组与D组高（P < 0.05），C组的OCN mRNA的表达情况较D组高，但差异无统计学意义（P > 0.05），且在第7天和第14天，A组与B组的碱性磷酸酶活性无统计学意义（P > 0.05）。
3 讨论
骨髓基质干细胞具有多向分化能力，取材广泛，能在各自特定的条件下分化为成骨细胞[6]，具有典型干细胞的特点[7-8]。BMSC不仅具有较强的增殖能力，而且随机体衰老，其仍能保持良好的干细胞特征。体外传代12代以上仍能保持正常的染色体组型和端粒酶活性，也就是在体外传代过程中可以维持其干细胞特性[9]。
成骨细胞具有分泌作用，可分泌骨形态发生蛋白[10]，碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子[11]、胰岛素样生长因子[12]等。研究表明，骨形态发生蛋白在体外培养下可以促进BMSCs成骨分化[13-14]，且BMP具有跨种诱导成骨的能力[15]。血小板衍生因子是刺激骨髓基质干细胞有丝分裂和迁移最重要的因素[16-17]。
微囊技术[5]，即以海藻酸钠和聚赖氨酸为材料，制备APA微囊，将分泌生长因子的细胞包裹在微囊内，与目的细胞共培养，当微囊在细胞分泌生长因子的条件下，使靶细胞定向分化。微球囊的成骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养后，在微球囊的成骨细胞分泌的多种生长因子作用下，骨髓间充质干细胞于体外定向分化为成骨细胞，共培养后微球囊包裹的成骨细胞可以完全去除，达到非接触共培养的目的。已有研究表明微囊化成骨细胞具有促进骨髓基质干细胞分化为成骨细胞的能力[18]，但是微囊化成骨细胞与骨髓基质干细胞的量效关系尚未见报道。
本实验首先探讨了微囊化成骨细胞与骨髓基质干细胞共培养时不同添加比例对BMSCs成骨分化的影响影响。实验发现，微囊化成骨细胞的添加浓度对骨髓基质干细胞的增殖没有明显统计学意义；添加的微囊化成骨细胞在1∶1浓度下已能促进骨髓基质干细胞成骨分化，且随着添加浓度的升高，促进骨髓基质干细胞分化的能力越强，但是在浓度达到10∶1之后提高浓度对促进骨髓基质干细胞分化的作用没有增强，并且证实10∶1的微囊化成骨细胞对骨髓基质干细胞的增殖达到最大的量效。
本研究的骨髓基质干细胞基于静态培养基诱导培养，而体内骨髓基质干细胞处于相对动态环境。在上述研究的基础上有必要进一步的深入研究，全面比较体外共培养时力学刺激因素能否促进骨髓基质干细胞的成熟分化，且加入力学刺激因素后需求的微囊化成骨细胞的量效关系。
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（收稿日期：2013-03-15）