育泡饮对自身免疫性卵巢损伤小鼠卵巢颗粒细胞的超微结构影响
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摘 要：目的：观察育泡饮对自身免疫性卵巢损伤小鼠卵巢颗粒细胞的超微结构影响。方法：以成熟的SD雌性大鼠卵巢组织制备卵巢抗原，皮下多点注射免疫 BALB/C雌性小鼠，建立卵巢早衰模型。在3次免疫后连续灌服育泡饮，以强的松为阳性对照，电镜观察小鼠卵巢超微结构变化。结果：模型组颗粒细胞胞体变小，各种细胞器明显减少，细胞核染色质凝聚，核膜消失，线粒体肿胀，嵴减少，紊乱，内质网扩张。育泡饮各剂量组可见颗粒细胞体积增大，胞质内细胞器数量增多，线粒体、内质网等结构大体正常，未见染色质凝聚。结论：育泡饮具有防止颗粒细胞凋亡的作用，能抑制颗粒细胞凋亡。
关键词：自身免疫；卵巢早衰；颗粒细胞；超微结构
中图分类号：R285.5
文献标识码：A
文章编号：1673-7717(2008)03-0502-03
Effects of Yupao Yin On the Ultra Structure of Ovarian Granular Cells in Mice with Autoimmune Ovarian Injury
LIANG Xin-yun1，SUN Xiao-fang2， NIU Jian-zhao1，WANG Ji-feng1，XU Hui-yu1，SHI Ren-bing3
(1.Laboratory of Cellular Biochemistry， Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China；
2.Department of Histology and Embryology，Hebei University， Baoding 071000，Hebai China；
3.College of Chinese Pharmacy， Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China)
Abstract：Objective：To assess the effects of Yupao Yin on the ultrastructure of ovarian granular cells in mice with autoimmune ovarian injury.Methods：BALB/C female mice model of POF was established by multiple sites subcutaneous injection of ovarian antigen elicited from ovarian tissue of mature SD female rats. The mice were treated with YupaoYin after 3 times of injection， with prednisone as positive control. Ultrastructural changes of ovarian granular cells were observed under electron microscope. Results：The mice in the model group had smaller granular cells with less cellular organs and assembled chromatin without caryotheca. Swollen，decreasing or disappearance of inner cristae of mitochondria and distinct dilatation of endoplasmic reticulum were seen .While in the Yupao Yin treated groups granular cells became larger，and the number of cell organs in cytoplasms increased. The morphogenesis of the mitochondria， endoplasmic reticulums became normal. No assembled chromatin was found. Conclusion：Yupao Yin can protect the granular cells from apoptosis.
Keywords：autoimmune；premature ovarian failure；granular cells；ultra structure
卵巢早衰(premature ovarian failure ，POF)是指40 岁以前出现至少4 个月以上闭经，并有≥2 次血清卵泡刺激素(FSH) > 40IU/ L(两次检查间隔>1个月)，雌二醇(E2 )
本研究用卵巢抗原免疫BALB/C小鼠建立POF动物模型，在3次免疫后给予实验小鼠连续灌服中药复方育泡饮，分析其超微结构的改变，从形态学角度探讨育泡饮治疗POF动物模型的作用机制，并为中医临床治疗POF提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 8～10周的雌性BALB/C小鼠70只，体重18～20g。购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
1.1.2药物及试剂 育泡饮由红花、淫羊藿、菟丝子、枸杞子组成，由北京中医药大学中药化学实验室提供，并制成相当生药1g/mL的浓缩液。
1.1.3 仪器 瑞典LKB公司NOVA-6型超薄切片机，日本日电公司JEM-1230型透射电子显微镜，美国MSE公司Soniprep150型超声粉碎机。
1.2 方法
1.2.1 动物分组 70只小鼠随机分为空白对照组、佐剂对照组、模型组、强的松组、育泡饮高剂量组、育泡饮中剂量组、育泡饮低剂量组，每组10只。
1.2.2 动物造模 ①卵巢抗原制备：在无菌条件下收集新鲜成熟SD雌性大鼠(体重约250g) 卵巢组织，称重，洗净，于Tris-HCl 缓冲液中剪碎并研磨成匀浆，低温下超声粉碎5min，4℃离心(4000r/min，15min；10000r/min，5min)，取上清液。用缓冲液调整溶液浓度，使每0.1mL 含卵巢组织20mg。
②动物造模：按照参考文献[4]，除空白对照组与佐剂对照组外，按大鼠10mg(0.05mL)卵巢抗原皮下多点注射免疫BALB/ C 雌性小鼠，佐剂对照组皮下多点注射Tri-HCl缓冲液，连续3 次，每2 周1 次，第1 次免疫加入等量完全弗氏佐剂进行乳化，第2 、3 次免疫加入等量不完全弗氏佐剂进行乳化。空白对照组皮下注射Tri-HCl缓冲液，连续3次，每2 周1 次。
1.2.3 给药 于第1次免疫后第8周开始给药，药物组均灌胃给药，每鼠每天灌胃0.5mL左右药液。药物剂量，按小鼠与人体表面积转换系数计算，育泡饮低剂量组、中剂量组、高剂量组及强的松组灌胃剂量分别为37.5g/(kg・d・只)、75g/(kg・d・只) 、150g/(kg・d・只)、2.6mg/(kg・d・只)灌胃，空白对照组、佐剂对照组及模型组均灌胃等量生理盐水，1次 /d，连用 4周。
1.2.4 透射电镜观察 免疫第12周，从各组中抽取2只小鼠，颈椎脱臼处死，速取卵巢，放入4℃的2.5%戊二醛固定，1%锇酸双固定，丙酮逐级脱水，超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅染色，于透射电子显微镜下观察。
2 结 果
空白对照组：生长卵泡的颗粒细胞形态为不规则的椭圆形，可见突起与透明带相连。细胞联结紧密。胞质内细胞器丰富，粗面内质网及滑面内质网丰富，线粒体丰富，嵴呈管状。细胞核大，染色质均匀，染色淡，可见1～2个核仁(见图1)。
佐剂组：生长卵泡的颗粒细胞形态为不规则椭圆形，可见突起与透明带相连。细胞联结欠紧密。胞质内细胞器丰富，粗面内质网及滑面内质网丰富，内质网轻度扩张，线粒体嵴呈管状，丰富，结构大致正常。细胞核大，染色质均匀，染色淡，可见1～2个核仁(见图2)。
模型组：生长卵泡的颗粒细胞体积明显变小，突起减少，与透明带之间的距离增大。颗粒细胞之间间隙增宽。胞质内细胞器明显减少，线粒体数量减少，明显肿胀，嵴数量减少，模糊不清(见图3)。内质网扩张明显。核膜消失，核内染色质凝集，固缩成块，或成不规则状位于细胞内(见图4)。
强的松组：生长卵泡的颗粒细胞体积增大，与空白对照组接近，突起增多，与透明带之间的距离与模型组相比减小。颗粒细胞之间间隙仍较大。胞质内细胞器增多，线粒体数量增多，稍肿胀，线粒体嵴仍模糊不清，内质网未见明显扩张。核内染色质凝集现象消失(见图5)。
育泡饮低剂量组：生长卵泡的颗粒细胞体积仍小，突起仍少，与透明带之间的距离减小。颗粒细胞之间间隙仍较宽。胞质内细胞器仍较少，线粒体数量稍增多，仍有部分肿胀，其嵴模糊不清，内质网仍有轻度扩张。核内染色质凝集现象消失(见图6)。
育泡饮中剂量组：生长卵泡的颗粒细胞体积变大，突起仍少，与透明带之间的距离减小。颗粒细胞之间间隙仍较宽。胞质内细胞器增多，线粒体数量增多，仍有部分肿胀，其嵴模糊不清，内质网未见明显扩张。核内染色质凝集现象消失(见图7)。
育泡饮高剂量组：生长卵泡的颗粒细胞体积变大，与空白对照组接近，突起增多，与透明带之间的距离减小。颗粒细胞之间间隙较窄。胞质内细胞器增多，线粒体数量增多，未见扩张，其嵴呈管状，结构大致正常，未见内质网扩张。核内染色质凝集现象消失(见图8)。
3 讨 论
肾气旺盛、肾精充足对天癸的成熟及功能的发挥起着直接的影响作用，对月经的产生起着主导作用和决定作用。中医认为，POF是由于肾气先衰，而致天癸早竭，以致任脉不通，太冲脉衰，血海空虚，终致闭经，而发为本病[5]。育泡饮由红花、淫羊藿、菟丝子、枸杞子组成。方用淫羊藿、菟丝子温补肾阳，枸杞子滋补肾阴，意在阴中求阳，加入红花，活血化瘀，共凑补肾活血之功效。以上配伍意在抑制卵巢的自身免疫损伤，促进卵泡发育。研究表明，补肾调冲中药含药血清可以抑制体外培养的颗粒细胞的凋亡[6]。
卵巢颗粒细胞分泌的雌激素对生殖器官发挥广泛的生理作用，为卵细胞的生长和发育提供了重要的环境，并且颗粒细胞还可以分泌抑制素等物质调节卵巢功能。当卵巢组织内抗卵巢抗体产生时，引起过度抗原抗体反应，造成颗粒细胞的过度损伤，导致卵巢功能下降甚至发生卵巢过早衰竭，卵巢分泌女性激素的能力下降，在临床上可见一系列围经期综合征的表现。
在本实验中可以发现，电镜下模型组小鼠卵巢颗粒细胞核内染色质凝集、固缩成块、核膜消失、内质网扩张明显，线粒体数量明显减少，线粒体嵴减少，紊乱，颗粒细胞间隙增宽与既往的文献报道相似[7]，这些都是细胞凋亡的表现。因此认为可能存在颗粒细胞的凋亡。颗粒细胞凋亡时细胞器中以线粒体和内质网变化最为敏感，内质网、线粒体与细胞凋亡密切相关。内质网对细胞凋亡的调控作用主要是通过对Ca2+调控以及内质网的应激反应来实现的[8-9]。在多种细胞凋亡信号的作用下，线粒体电子传递链与ATP生成氧化磷酸化解偶联，跨膜电位降低，ATP合成减少，还原性谷胱甘肽减少，细胞内活性氧过度生成，引起细胞凋亡[10]。将鼠线粒体与卵巢颗粒细胞共同培养后发现，线粒体有防止颗粒细胞凋亡的作用， 线粒体DNA 缺失后使颗粒细胞凋亡加速而引起卵巢早衰[11]。已有研究表明，POF 患者线粒体DNA 明显减少[12]。
在笔者以往的研究中发现自身免疫性卵巢损伤小鼠E2水平下降，FSH水平上升，光镜下可见卵巢各级卵泡及黄体数量减少。本实验观察了自身免疫性卵巢早衰小鼠颗粒细胞超微结构的异常变化，从形态学上进一步明确了颗粒细胞损伤的存在，是自身免疫性卵巢早衰小鼠E2水平下降的一个重要原因。
本实验提示，佐剂对照组卵巢颗粒细胞超微结构与空白对照组比较无明显变化。强的松组与育泡饮各剂量组颗粒细胞超微结构不同程度地有所改善。其中以育泡饮高剂量组效果更为明显，其效果与强的松相似，说明育泡饮能够改善卵巢颗粒细胞的超微结构，抑制颗粒细胞凋亡，从形态学角度阐明了育泡饮对自身免疫性卵巢损伤小鼠卵巢的保护作用。
参考文献
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