RP-HPLC同时测定克银颗粒中的靛蓝和靛玉红

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[摘要] 目的 建立克银颗粒中靛蓝和靛玉红含量的测定方法。 方法 采用HPLC法定量分析，色谱柱为Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（80∶20，V/V），流速为1.0 mL/min，柱温为30℃；靛蓝的检测波长为287 nm，靛玉红为292 nm。 结果 靛蓝在0.329～32.900 μg/mL范围内线性关系良好，Y = 56.94C-1.749（r = 0.999 8），靛玉红在0.390～39.000 μg/mL（r = 0.999 9）范围内线性关系良好，Y = 119.1C+19.71（r = 0.999 9），其平均回收率分别为99.89%（RSD = 1.00%，n = 5）、99.18％（RSD = 0.48%，n = 5）。 结论 所建立的方法简便、准确、重复性好，可用于克银颗粒的质量控制。

[关键词] 克银颗粒；靛蓝；靛玉红；高效液相色谱法

[中图分类号] R917 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）01（b）-120-03

Determination of indigo and indirubin in Keyin Granule by rp-hplc

LIU Mei1 YE Zichen2 WANG Qingwei1 XU Yuan1 DANG Xueliang1

1.Department of Pharmacy, Tangdu Hospital of Fourth Military Medical University, Shaanxi Province, Xi′an 710038, China; 2.College of Pharmacy, Fourth Military Medical University, Shaanxi Province, Xi′an 710032, China

[Abstract] Objective To determine the contents of indigo and indirubin in Keyin Granule. Methods The contents of indigo and indirubin were determined by HPLC. The chromatographic column was Phenomenex C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm), the mobile phase was methanol-water (80∶20, V/V), the flow rate was 1.0 mL/min and the temperature of column was 30℃ with detection wavelength of 287 nm for indigo and 292 nm for indirubin. Results The linear correlation of the indigo was in the range of 0.329-32.900 μg/mL [Y = 56.94C-1.749 (r = 0.999 8)] and the recovery was 99.89% with RSD of 1.00% (n = 5). The linear correlation of the indirubin was in the range of 0.390-39.000 μg/mL [Y = 119.1C+19.71 (r = 0.999 9)] and the recovery was 99.18% with RSD of 0.48% (n = 5). Conclusion The method can be applied to determine the contents of indigo and indirubin in Keyin Granule. It can ensure the stability of the quality control of Keyin Granule.

[Key words] Keyin Granule; Indigo; Indirubin; HPLC

克银颗粒是由青黛、苦参、白花蛇舌草等九味药组成的复方制剂，该药具有清热解毒、凉血活血、祛风止痒的功效，是第四军医大学唐都医院皮肤科治疗银屑病的经验方。处方中君药青黛具有清热解毒、凉血消斑、泻火定惊的功能，用于温毒发斑、血热吐衄、胸痛咳血、口疮、痄腮、喉痹、小儿惊痫[1-2]。青黛的主要有效成分是靛蓝和靛玉红，为了有效控制该制剂质量，本文采用反相高效液相色谱法同时测定克银颗粒中青黛主要药效成分靛蓝和靛玉红的含量，结果显示，所建立的方法简便、准确、可靠，为克银颗粒质量控制研究提供了实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

美国Agilent 1100高效液相色谱仪（Agilent 1100泵，Agilent 1100 DAD检测器，Agilent 2100色谱工作站）；BP211D电子分析天平（德国Sartorius公司）；KQ-32000DB型数控超声波仪（昆山超声仪器有限公司）。

1.2 试药

靛蓝对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110716-200610）、靛玉红对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110717-200204）；甲醇为色谱纯；水为超纯水；其余试剂为分析纯；克银颗粒（第四军医大学唐都医院药剂科制备，批号：20100111、20100118、20100125）。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称量靛蓝对照品3.29 mg，加N，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解并稀释成164.5 μg/mL的靛蓝对照品储备溶液。另精密称取3.90 mg靛玉红对照品，加DMF溶解并稀释成195.0 μg/mL的靛玉红对照品储备溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取克银颗粒样品研磨成细粉，精密称量1.0 g，加50 mL DMF，超声处理（250 W，33 kHz）30 min，转入100 mL量瓶中并定容；精密吸取1.0 mL续滤液，用甲醇稀释至10 mL的量瓶中，用于靛蓝的含量测定；另取续滤液5 mL，用甲醇稀释至10 mL的量瓶中，用于靛玉红的含量测定。

2.1.3 阴性对照溶液的制备 取缺青黛的克银颗粒处方制备阴性样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱为Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（80∶20，V/V），流速为1.0 mL/min，柱温为30℃；靛蓝的检测波长为287 nm，靛玉红的检测波长为292 nm。理论板数分别按靛蓝峰和靛玉红峰计算均应不低于3 000。

2.3 系统适用性试验

取供试品溶液、阴性供试品溶液及适当浓度的靛蓝、靛玉红对照品溶液，于不同波长的色谱条件进样。在靛蓝、靛玉红对照品相应色谱峰位置处无其他色谱峰出现，靛蓝的保留时间为5.8 min（287 nm），靛玉红的保留时间为7.9 min（292 nm）。见图1～2。

A.靛玉红对照品；B.阴性对照样品；C.克银颗粒样品；a.靛蓝峰；b.靛玉红峰

图2 靛玉红对照品、阴性对照样品、克银颗粒样品HPLC色谱

2.4 线性关系考察

取“2.1”项下靛蓝对照品储备液，用甲醇逐步稀释成0.329、1.650、3.290、8.225、16.450、24.680、32.900 μg/mL，取适量靛玉红对照品储备液逐步稀释成0.390、1.850、3.900、9.250、18.500、28.750、39.000 μg/mL系列浓度的对照品溶液，在上述色谱条件下进样，以对照品浓度C为横坐标，峰面积Y为纵坐标，得到靛蓝和靛玉红靛蓝标准曲线回归方程分别为Y = 56.94C-1.749（r = 0.999 8）；Y = 119.1C+19.71（r = 0.999 9）。结果表明靛蓝在0.329～32.900 μg/mL范围内，靛玉红在0.390～39.000 μg/mL范围内，药物浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 稳定性试验

取供试品溶液，在配制后0、4、8、12、24 h于靛蓝和靛玉红的色谱条件下分别进样，靛蓝、靛玉红峰面积的RSD分别为0.86%和0.79%。结果表明样品溶液在室温下24 h内稳定。

2.6 精密度考察

取靛蓝和靛玉红对照品溶液（靛蓝浓度为16.45 μg/mL、靛玉红浓度为18.50 μg/mL），于各自色谱条件下同一天连续进样5次，测定峰面积，计算靛蓝和靛玉红日内RSD分别为0.78%和0.88%；连续3 d进样5次，测定峰面积，计算靛蓝和靛玉红日间RSD分别为1.03%和1.12%。结果表明仪器与色谱条件具有良好的精密度。

2.7 重复性试验

取同一批样品6份，分别按样品测定方法测定。每10 g克银颗粒中靛蓝的平均含量为69.850 mg，RSD = 0.92％；靛玉红的平均含量为2.622 mg，RSD=1.01% 。

2.8 加样回收率试验

精密称量已知靛蓝和靛玉红含量的克银颗粒（每克颗粒剂含靛蓝6.985 0 mg，含靛玉红0.262 2 mg）1.103 g，加DMF 50 mL，超声30 min用甲醇定容至100 mL量瓶中，过滤，平行取6份续滤液各1 mL，分成3组，每组2份，分别加入靛蓝对照品溶液（82.25 μg/mL）0.1、1.0、3.0 mL，甲醇定容至10 mL。另平行取6份续滤液各5.0 mL，分成3组，每组2份，分别加入靛玉红对照品溶液（97.50 μg/mL）0.1、1.0、3.0 mL，甲醇定容至10 mL。分别于不同波长的色谱条件下进样，记录色谱图，按外标法计算靛蓝和靛玉红的含量，并计算加样回收率。结果见表1。

表1 靛蓝和靛玉红的加样回收率试验结果

2.9 样品含量测定

取3批样品，分别按供试品溶液制备方法制得供试品溶液，按上述色谱条件分别测定其含量，按外标法计算靛蓝与靛玉红的含量，结果3批样品中每袋含靛蓝平均值为68.82 mg，靛玉红平均值为2.54 mg。结果见表2。

3 讨论

《中国药典》2010年版采用液相色谱测定青黛中的靛蓝和靛玉红进行控制质量。靛蓝和靛玉红为同分异构体，脂溶性均较强，在很多试剂中溶解性较差，《中国药典》2010年版测定青黛中靛蓝的含量时，用2%水合氯醛的三氯甲烷溶液作为溶剂进行超声处理，以606 nm作为检测波长，笔者发现很多液相的紫外-可见检测器无606 nm的设置。采用600 nm测定靛蓝的含量，灵敏度低，重复性差且误差大，与文献[3]报道一致。故本文采用检测波长为287 nm和292 nm分别来测定靛蓝和靛玉红含量，效果较好。

有文献先用三氯甲烷回流溶解后再用异丙醇和甲醇逐步稀释的方法配制对照品，本文先以DMF为溶剂，超声30 min溶解后再用甲醇逐步稀释，可确保靛蓝与靛玉红溶解完全，配制过程中无沉淀析出，最终溶剂与流动相相接近。

[参考文献]

[1] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：185.

[2] 白宗利，任玉珍，陈彦琳，等.HPLC测定市售青黛中靛蓝和靛玉红的含量[J].中国现代中药，2010，12（8）：27-32.

[3] 谌立巍，廖婉，杨明，等.HPLC测定青黛中的靛蓝和靛玉红[J].华西药学杂志，2008，23（6）：714-715.

[4] 彭文进，赵士冶，冯秀珍，等.高效液相色谱法测定小儿感冒颗粒中靛蓝与靛玉红的含量[J].中国现代药物应用，2009，3（6）：1-2.

（收稿日期：2011-06-10）