高雄山虫草人工栽培菌株筛选及搔菌对其子实体生物量的影响
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以小麦粒固体培养基栽培高雄山虫草。筛选了适于生产的优良菌株，该菌株栽培后生长良好，搔菌后出草较多、整齐，但生物量和生物转化率与未搔菌相比没有明显差异；搔菌组第二潮子实体生物量和生物转化率均优于未搔菌组，搔菌组平均每瓶分别为（0.33±0.01） g和（2.2±0.01）%，未搔菌组分别为（0.12±0.01） g和（0.7±0.01）%。经过二潮子实体培养总生物量和总生物转化率高于一次培养。
高雄山虫草； 搔菌；子实体生物量； 生物转化率
高雄山虫草（Cordyceps takaomontana）的无性型为细脚棒束孢（Isaria tenuipes），1879年首次对其进行了描述，1974年更名为细脚拟青霉（Paecilomyces tenuipes）［1］，2005年LUANGSA-ARD等［2］基于分子系统发育研究，将该其重新更名为细脚棒束孢，其子实体和发酵液含有多种有效活性组分，具有抗肿瘤、抗菌、清除体内自由基以及改善睡眠和抗忧郁等作用，因此该虫草受到中外食药用菌研究者的关注［3-6］。南韩和日本作为“新型冬虫夏草”——雪花虫草已不断推出各种产品［7］，目前市场上有常规的饮料、茶、胶囊等产品，还有用细脚棒束孢子实体浸出物与灵芝浸出物、果糖、苹果汁、柠檬酸和牛磺酸等组配成用以强身健体，提高免疫力和防癌的混合饮料，或以细脚棒束孢子实体粉剂（或浸出物）与褐米、小麦、蜂蜜、绿茶、人参等一起配制冲服食品，用于预防高血压、糖尿病等。新产品的不断涌现推动了其培养工艺和工艺条件的发展［8,9］。
为了进一步为高雄山虫草子实体的人工规模化生产提供技术资料，本研究采用小麦粒为主要成分的固体培养基培养高雄山虫草，并尝试寻找提高其子实体生物量与生物转化率的有效手段。
1 材料与方法
1.1菌株
采自河南省的GZUIFR-PT123、PT274和PT230，四川省的W090861，云南省的PTXS-1和贵州省的PTSL-20菌株参照SAMSON［10］的方法，根据韩燕峰［11］ 和梁宗琦等［12］的描述，经梁宗琦教授鉴定为高雄山虫草（C. takaomontana）无性型细脚棒束孢（Isaria tenuipes），这些野生菌株均寄生于鳞翅目类昆虫，全部菌株现皆保存于贵州大学生命科学学院真菌资源研究所。
1.2培养基
PDA培养基：200 g马铃薯，20 g葡萄糖， 18 g琼脂，补充自来水至1 L，pH自然。
液体培养基：PDA培养基不加琼脂，其余同。
小麦粒固体培养基：15 g小麦粒，4 g蚕蛹粉，0.5 g麦芽糖，10 mL营养液（0.1% CaCl 2， 0.5% ZnSO 4，0.5% MgSO 4，5 mg维生素B 1），自来水25 mL。
1.3母种制备及接种
菌种在PDA斜面培养基上25 ℃培养5 d后，刮取培养物至20 mL的含有0.1% 吐温80的无菌水中，混匀，无菌擦镜纸过滤，血球计数板计数，调整孢子悬液至1×108个/mL。接种 5 mL孢子悬液至装有50 mL的液体培养基的250 mL三角瓶中，25 ℃、200 r/min摇床培养 5 d取出。
1.4PDA中不同菌株产子实体能力比较
将不同菌株斜面菌种点种于PDA平板上， 25 ℃温箱培养15 d，比较菌落形态和产子实体 情况。
1.5生物转化率的测定
将取出的液体菌种（5 mL）接种至装有15 g小麦粒固体培养基的无色玻璃瓶中（高13 cm，直径6 cm）。于25 ℃暗培养至菌丝长满培养料（ 8～10 d）后，搔去表面0.3～0.5 cm的菌丝，不搔菌的作为对照。22 ℃、28 w日光灯下诱导子实体产生。采收第一批子实体后重新扎紧塑料薄膜继续培养。分别记录两批子实体的生物量，计算生物转化率。每个实验组为15瓶，3个重复。
生物转化率=子实体干重/培养料干重×100%
2 结果与分析
2.1PDA中不同菌株的产子实体能力
高雄山虫草不同来源菌株的菌落形态和产子实体能力有明显差异（图1），可粗分为5种类型：
韩燕峰，等：高雄山虫草人工栽培菌株筛选及搔菌对其子实体生物量的影响
1： GZUIFR-PT123; 2： PT274; 3： W0908613; 4： PT230; 5： PTSL-20; 6： PTXS-1
a 产子实体快、多且分枝少，例如，GZUIFR-PT123；
b 产子实体，但多分枝，例如，PT274；
c 产子实体少，多呈卷毛状，例如，W0908613；
d 产子实体少，菌落表面疏松或致密，分生孢子多，例如，PT230和PTSL-20；
e 菌落表面绒毛状，无子实体形成，例如，PTXS-1。
从子实体较好采收和较高产量的需要出发，属于a、b类型的菌株可用于生产。c、d、e类型的菌株产子实体能力差，不适于人工培育；此外，有的菌株会产生较多孢子，在生产过程中对管理人员可能造成不良影响。故本研究选用了属于a类型的GZUIFR-PT123菌株用于培养实验，因其子实体分枝不多且产分生孢子较少等优良生产性状。
2.2搔菌对子实体生物量的影响
自接种小麦粒固体培养基后15 d开始产生子实体原基，40 d子实体成熟，搔菌的培养瓶中子实体数量较多，生长高度较一致（5～7 cm），未搔菌的培养瓶中子实体的平均高度高于搔菌组，但参差不齐。搔菌组平均每瓶生物量为（2.62±0.03）g，生物转化率为（17.47± 0.02）%；未搔菌组生物量为（2.58±0.02）g，生物转化率为（ 17.13±0.01）%，生物量和生物转化率在两组间无明显差异。
采收第一潮子实体后培养25 d，第二潮子实体也可高达8～9 cm，搔菌组与未搔菌组没有差异。但搔菌后子实体生物量和生物转化率均优于未搔菌，搔菌组平均每瓶分别为（0.33± 0.01）g和（2.2±0.01）%，未搔菌组则分别为（0.12±0.01）g和（0.7±0.01）%。经过二潮子实体培养总生物量和总生物转化率高于一次培养。