油脂及油炸食品中BHA、BHT、TBHQ和PG四种抗氧化剂的检测
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摘要：油脂及油炸食品在运输和储存过程中,易与空气中的氧气发生反应,使产品氧化而变味、变质。为了防止油脂氧化,常需要在这类食品中添加抗氧化剂，如丁基羟基茴香醚（bha）、二丁基羟基甲苯(bht)、特丁基对苯二酚(tbhq)和没食子酸丙酯（pg）就是四种油脂类食品中常用的抗氧化剂，但是这类抗氧化剂往往是具有一定的毒副作用，如何快速有效对这四种抗氧化剂进行同时检测显得十分重要，试验证明采用二元梯度洗脱的高效液相色谱法对其检出效果较好。
关键词：抗氧化剂 液相色谱检测 pH值控制 波长选择
引言：
抗氧化剂通常用于油脂和油炸食品中，阻止或延缓食品氧化变质、提高食品稳定性和延长食品贮存期的一种食品添加剂。抗氧化剂按来源分为天然抗氧化剂和人工合成抗氧化剂，油脂和油炸食品中常用的抗氧化剂包括丁基羟基茴香醚（BHA）、二丁基羟基甲苯(BHT)、特丁基对苯二酚(TBHQ)和没食子酸丙酯（PG）,这类抗氧化剂对人体有一定的毒害作用, 有害于人们的身心健康，GB 2760《食品添加剂使用标准》中严格规定了这类抗氧化剂的使用范围和使用量。我国先后制订了多个关于抗氧化剂的检测标准，规定了相关的相测方法和条件，本方法采用二元梯度洗脱的高效液相色谱法，通过多次实验验证，更适合对油脂及油炸食品中四种抗氧化剂的同时检测。
一、检测仪器和步骤
1、仪器设备和试剂
仪器试备：液相检测采用的是戴安高效液相色谱仪，配合紫外线检测器和四元梯度输液泵；检测仪器还包括蒸发仪、离心机和过滤器等。
试剂：乙酸水溶液（利用超纯水加优级纯冰乙酸进行制备，pH3.0，0.45μm水系滤膜处理）；甲醇（HPLC级别，0.45μm有机系滤膜进行处理）；丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、叔丁基对苯二酚、没食子酸丙酯的标准溶液（称取四种抗氧化剂各50mg，分别用甲醇定容到50mL，制备后的标准溶液相当于BHA、BHT、TBHQ和PG的1mg/mL溶液）。
2、检测条件
色谱柱设置：VP-ODS250mm×4.6，C18,10μm；流动相设置：A液设置为pH3.0乙酸溶液，B液设置为甲醇溶液；泵流速度为1.0mL/min；检测采用280nm波长；试剂进样量20μL；二元体梯度洗脱设置：为0-4分钟，30%B液；4-10分钟，63%B液；10-16分钟，90%B液；16-25分钟，30%B液。
3、样品处理
油脂类样品：称取样品5g（精确至0.01g），置于10mL离心管中并加入5mL甲醇，摇动2min，并进行冷却，以2000r/min离心5min，将处理后的上清液置于100mL圆底烧瓶中，残留夜继续用5mL甲醇提取，反复3次，合并上清液。在40℃水浴中进行蒸发处理，去除甲醇，剩余液体为3-4mL即可，随后移入10mL离心管，用少量甲醇冲洗烧瓶，并将洗涤液置入离心管，甲醇定容到刻度，随后离心5min，并提取上清液用0.45μm滤膜处理，供液相色谱检测。
油炸类样品：根据油脂含量，称取样品50-100g（精确至0.01g），加入50mL的石油醚（沸程30-60）+乙醚，比例为40:10，振动提取30min，完成后利用滤纸过滤，置入250mL的圆底烧瓶中，然后利用相同的石油醚（沸程30-60）+乙醚进行冲洗，合并滤液后进行水浴蒸发，回收残留脂肪，称取样品5g（精确至0.01g），同油脂类样品操作。
二、检测过程与结果分析
1、检测最佳分离条件
从流动相和比例的选择上看，检测分别采用的是甲醇/乙酸溶液(pH3.0)，以及乙腈/磷酸钠缓冲液为流动相进行了对比。从试验的结果看，乙腈/磷酸钠缓冲液对BHA、BHT和PG的检出效果较好，但是TBHQ的分离效果差，同时乙腈的毒性更高，且磷酸钠缓冲液的制备较复杂，在色谱柱中容易沉淀影响检测系管路畅通，影响泵送效果，所以没有采用此种溶剂进行试验。
在试验中利用甲醇/乙酸(pH3.0)为液体流动相，并采用不同比例进行测试。试验的结果表明，四种测试对象的极性顺序为PG、TBHQ、BHA和BHT。甲醇/超纯水的比例为65/35的环境中流动相极性大，而BHT没有峰值，90/10时各组分存留时间短，且分离效果差；75/25、80/20、85/15的情况下BHA、BHT的分离效果较好，但是PG、TBHQ存留时间短，无法有效分离。因此在测试中选择甲醇/乙酸(pH3.0)水溶液进行二液梯度处理的方式，可以使得检测对象25分钟内分离完全效果最佳。
图：空白加标样品色谱图（1．PG 2．TBHQ 3．BHA 4．BHT）
2、pH值对峰值干扰
在测试中PG极性大且拖尾情况严重，加入冰乙酸后得到了一定的改进。在100mL超纯水的流动相中加入冰乙酸，对纯水的pH值进行调试，制备2.0、3.0、5.0、6.0和7.0进行分组试验，结果证明pH值接近中性的拖尾情况越发严重，而酸性越强其PG的峰值越明显，但是乙酸的含量高对柱子会产生负面影响，所以在试验中采用甲醇/乙酸溶液(pH3.0)作为流动相完成测试。
3、波长的选择
在相关的研究中，针对这四种抗氧化剂的检测，波长为230nm、254nm，但在试验中比较了多种波长后发现，230nm、254nm作为检测波虽然可以保证BHA、BHT、PG的检测灵敏度，但是TBHQ的检测灵敏度则明显降低，为此在本实验的检测中也进行了相关的测试，最终表明，最佳的检测波长为280nm。
三、结束语
总结前面的试验过程与测试结果，不难看出采用甲醇/乙酸(pH3.0)溶液二液梯度洗脱高效液相色谱检测法对油脂与油炸食品中的四种抗氧化剂的检测过程中，即对丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、叔丁基对苯二酚和没食子酸丙酯的检测，这种方式与以往的国标法相比，对四种抗氧化剂的检出限制较低，对四种抗氧化剂的回收率都达到了90-99%的效果，说明此种方法在检测中有一定的可靠性，且试剂的成本较低，操作简单。同时采用二液梯度测试方法克服了单一浓度配比流动相检测所带来的多种组分分离效果不佳的情况，在流动相中加入冰乙酸调节pH更有效的减轻了PG检测中的拖尾情况，测试最佳的波长为280nm，提高了灵敏度保证了在有效时间内四种抗氧化剂的检测效果。
参考文献：
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