黄精炮制过程中甾体皂苷的变化研究

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摘要：目的甾体皂苷在炮制过程中发生的化学变化，目前很少有研究。本研究为进一步开发利用药用植物中的甾体皂苷提供思路。方法从黄精中分离原料化合物薯蓣皂苷，用水合反应釜模拟炮制过程对单体进行转化，TLC确定完全转化时的温度与时间，运用正向和反向硅胶柱层析，分离2个主要化合物。结果通过LC-MS、NMR等波谱解析法，确定薯蓣皂苷在炮制过程中转化为延龄草苷和薯蓣皂苷元。结论现代炮制研究对比了黄精炮制前后薯蓣皂苷的变化，本研究与以往黄精炮制不同，发现炮制过程中甾体皂苷确实发生了很重要的变化，生成次级苷和苷元。

关键词：黄精；炮制；甾体皂苷；薯蓣皂苷

中图分类号：R283文献标志码：A文章编号：1007-2349（2017）05-0072-04

[WT5HZ][JZ]Study on the Change of Steroidal Saponins in the Processing of Polygonatum

[WT5BZ][JZ]WANG Qian， LIU Xing， XU Min， LI Hai-zhou

[WT5"BX][JZ]（School of Life Science and Technology， Kunming University of Science and Technology， Kunming 650500， Yunnan）

[WTHZ]【Abstract】[WTBZ]Objective： To study the chemical changes of steroidal saponins in the process of Polygonatum and provide a way to further develop steroidal saponins in medicinal plants. Methods： Dioscin was isolated from Polygonatum sibiricum and hydration reactor simulation was used to concoct a process to transform monomer. The temperature and time of the complete conversion were determined by TLC. Two main compounds were separated by forward and reverse silica gel column chromatography. Results： By LC-MS and NMR wave spectrum analysis， dioscin was determined to be transformed into disogluside and diosgenin in the process of preparation. Conclusion： The changes of dioscin before and after the processing by present method are compared， different from traditional processing， and it is found that the steroidal saponins in the process has greatly changed， producing secondary glycosides and aglycones.

[WTHZ]【Key words】[WTBZ]Polygonatum， preparation， steroidal saponins， dioscin

[JP2]甾w皂苷具有多种生物活性[1]，广泛存在于单子叶植物的百合科、石蒜科、薯蓣科和蒺藜科等植物中；中药有黄精、穿山龙、知母、麦冬、玉竹等。国内早有以含甾体皂苷为主成分的中成药应用于临床，如中药制剂“心脑舒通”、“冠心宁”、“麦冬汤剂”等。黄精始载于《名医别录》，《中国药典》2015版规定黄精为百合科植物滇黄精Polygonatum kingianum Collet Hemsl、黄精Polygonatum sibiricum Red或多花黄精Polygonatum cyrtonema Hua的干燥根茎[2]，最早我国唐朝的孙思邈在《千金翼方》中提到黄精“九蒸九曝”的炮制方法[3]，发生麦拉德反应，产生有毒物质5-羟甲基糠醛（5-HMF）[4]。黄精中含有多种甾体皂苷以薯蓣皂苷为主，用中药材中单体转化模拟炮制的研究报道还很少。分析炮制前后发生的化学变化，为研究甾体皂苷炮制理论和减毒增效机制的科学性提供实践参考。[JP]

1仪器与材料

11仪器电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；DF-35型粉碎机（温岭市林大机械有限公司生产）；DK-8D型电热恒温水槽；Water purifier 实验室专用超纯水机；BS/BT系列电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司生产）；EYELAN-1100型旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司生产）；SK-2200HP型超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限公司生产）；SHZ-D（III）型循环水多用真空泵（巩义市予华仪器有限公司）；Bruker DRX-500，Bruker AM-400及AVANCEIII-600型超导核磁共振仪（Bruker BioSpin group，Germany）；API QSTAR TOF质谱仪（Applied Biosystem Corporation，Canada）；JASCO DIP-370型数显旋光仪（JASCO Co，Ltd，USA）测定旋光度；分析型HPLC为Agilent1200型高效液相色谱仪（Agilent Technologies Co，Ltd，USA）；色谱柱为ZORBAX SB-C18（Agilent，46×250 mm，1 mL/min）。[JP2]

12柱色谱材料薄层层析（TLC）正向硅胶板为G型和H型（青岛海洋化工厂生产）；制备TLC采用G型薄层正向硅胶板（青岛海洋化工厂生产）；[HJ2.3mm]拌样硅胶80-100目，柱层析硅胶100-200目和200-300目（青岛海洋化工厂生产）；反向填充材料 Lichroprep RP-18（40-63μm）；MCI填充材料MCI-gel CHP-20P（日本Mitsubishi化W公司生产）；ODS（YMC*Gel ODS-A，50μm，YMC CoLtdJapan）；MERCK Silica gel 60（MERCK，Darmstadt，Germany）；TLC显色剂为5% H2SO4-EtOH溶液、A试剂（茴香醛/浓硫酸/乙醇=1∶[KG-*2]1∶[KG-*2]18，v/v）、Ehrlich试剂（对-二甲氨基苯甲醛∶[KG-*2]浓盐酸∶[KG-*2]甲醇=1 g∶[KG-*2]35 mL∶[KG-*2]75 mL）[JP]

13试剂实验用溶剂工业级甲醇、氯仿、二氯甲烷等，经过重蒸后使用；分析纯为天津化学试剂有限公司生产；色谱纯甲醇、乙腈为德国Merck公司生产；超纯水由实验室纯水系统ULUPURE HYRO-40系统获得。

14材料黄精根茎于2015年8月采购于云南宣威，共10 kg。本样品由昆明理工大学生命科学与技术学院李海舟教授鉴定为滇黄精Polygonatum kingianum CollEt Hemsl。样品标本现存放于昆明理工大学生命科学与技术学院药物化学与生物学实验室，标本号为KMUST20150808。

2实验方法

21目标单体化合物薯蓣皂苷的分离纯化

211分离纯化取滇黄精干燥根茎5 kg，经粉碎后用75%甲醇-水提取2次，每次24 h。将提取液合并，过滤，旋转蒸发仪蒸干得到粗提物。用少量甲醇溶解，以80-100目硅胶拌样，经200-300目硅胶柱层析，用氯仿-甲醇（9：1，5：1，2：1，1：1，0：1）依次洗脱得到5个部分（Fr1-Fr5）。Fr1（10 g）经反相硅胶柱层析ODS，用纯水及20%，40%，60%，80%，100%甲醇-水依次洗脱得到单糖、呋甾和螺甾3个部分（Fr1-1、Fr1-2、Fr1-3）。Fr1-3（52 g）经YMC-ODS反相柱层析（20%-100%甲醇-水，梯度洗脱），分离纯化得到目标化合物薯蓣皂苷（20 g）。

212结构鉴定薯蓣皂苷，白色无定形粉末，A试剂显绿色，Ehrlich试剂不显色，说明该化合物为螺甾烷型化合物。根据正离子ESICMS给出[M+H]+峰，m/z869，结合13C NMR数据推出化合物分子式为C45H72O16。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ 530（1H，brd，J = 45 Hz，H-6），088（3H，s，H-18），106（3H，s，H-19），115（3H，d，J = 68 Hz，H-21），070（3H，d，J = 50 Hz，H-27），499（1H，d，J = 86 Hz，H-1′Glu），586，（1H，brs，H-1″Rha），164（3H，d，J = 62 Hz，H-6″Rha），641（1H，brs，H-1Rha），177（3H，d，J=61 Hz，H-6Rha）；13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ 372（C-1），294（C-2），767（C-3），380（C-4），1407（C-5），1217（C-6），314（C-7），313（C-8），500（C-9），368（C-10），208（C-11），394（C-12），402（C-13），562（C-14），319（C-15），806（C-16），622（C-17），164（C-18），194（C-19），415（C-20），150（C-21），1089（C-22），313（C-23），289（C-24），302（C-25），663（C-26），175（C-27），986（C-1′），774（C-2′），765（C-3′），772（C-4′），774（C-5′），605（C-6′），1009（C-1″），710（C-2″），708（C-3″），756（C-4″），691（C-5″），181（C-6″），1007（C-1），710（C-2），711（C-3），723（C-4），684（C-5），182（C-6）其NMR数据与文献报道[5]基本一致，故确定化合物1为薯蓣皂苷（Dioscin）。

22薯蓣皂苷单体模拟炮制过程

221模拟炮制取薯蓣皂苷2 g，加少量甲醇和水60℃恒温水浴锅中溶解，配制成20 mg/mL的溶液。取30 mL溶液倒入水合反应釜中，在鼓风干燥箱中100℃反应6 h，模拟炮制过程。

222水合反应后分离纯化将炮制后的转化溶液用旋转蒸发仪蒸干，称量转化产物。将17 g转化产物经反相硅胶柱层析ODS，用纯水及30%，60%，90%，100%甲醇-水依次洗脱得到3个部分（Fr1、Fr2、Fr3）。Fr2经500-600目硅胶柱，用二氯甲烷-甲醇（100：1，50：1，40：1，30：1，20：1，10：1）依次梯度洗脱得到化合物2和化合物3。

223结构鉴定化合物2，白色无定型粉末，A试剂显绿色，Ehrlich试剂不显色，说明该化合物为螺甾烷型化合物。ESICMS：m/z 577[M+H]+；结合13C NMR数据推出化合物分子式为C33H52O8。1H NMR（600 MHz，in pyridine-d5）δH：064（3H，d，J=51 Hz，CH3-27），078（3H，s，CH3-18），090（3H，s，CH3-19），109（3H，d，J=69 Hz，CH3-21），503（1H，d，J=84 Hz），526（brs，H-6）。13C NMR（150 MHz，in pyridine-d5）δC：392（t，C-1），321（t，C-2），784（d，C-3），418（t，C-4），1408（s，C-5），1216（d，C-6），321（t，C-7），317（d，C-8），501（d，C-9），370（s，C-10），210（t，C-11），373（t，C-12），398（s，C-13），565（d，C-14），315（t，C-15），810（d，C-16），627（d，C-17），162（q，C-18），193（q，C-19），403（d，C-20），150（q，C-21），1091（s，C-22），301（t，C-23），291（t，C-24），305（d，C-25），667（t，C-26），172（q，C-27），1025（d，C-1′），753（d，C-2′），785（d，C-3′），716（d，C-4′），780（d，C-5′），627（t，C-6′）；其NMR数据与文献报道[6，7，8]基本一致，故确定化合物2结构为（25R）-spirost-5-en-3β-ol 3-O-β-D-glucopyranoside，即延龄草苷（Trillin）。

化合物3，白色无定型粉末，A试剂显绿色，Ehrlich试剂不显色，说明该化合物为螺甾烷型化合物。ESICMS：m/z 415[M+H]+；结合13C NMR数据推出化合物分子式为C27H42O3。1H NMR（600 MHz，in pyridine-d5），δH：358（1H，m，H-3），538（1H，d，J=47 Hz，H-6），375（1H，m，H-16），105（3H，s，H-18），131（3H，s，H-19），096（3H，d，J=71 Hz，H-21），356（2H，m，H-26），095（3H，d，J=63 Hz，H-27）；13C NMR（150 MHz，in pyridine-d5），δC：398（t，C-1），322（t，C-2），711（d，C-3），434（t，C-4），1419（s，C-5），1209（d，C-6），325（t，C-7），321（d，C-8），503（d，C-9），369（s，C-10），211（t，C-11），377（t，C-12），404（s，C-13），566（d，C-14），317（t，C-15），810（d，C-16），628（d，C-17），163（q，C-18），195（q，C-19），419（d，C-20），150（q，C-21），1092（s，C-22），305（t，C-23），291（t，C-24），316（d，C-25），667（t，C-26），172（q，C-27）；其NMR稻萦胛南妆ǖ[9]基本一致，故确定化合物3结构为（25R）-Spirost-5-en-3β-ol，即薯蓣皂苷元（Diosgenin）。

23黄精生药材炮制

231炮制过程取200 g黄精切片（切片后可能会缩短炮制时间），用超声波法，提取溶剂选择75%乙醇，料液比15：1，PH=6的条件下超声提取2 h。提取后的溶液过滤后用旋转蒸发仪蒸干制成浸膏，称取少部分浸膏，配成50 g/L的溶液，于水合反应釜中在100℃鼓风干燥箱中反应6h，进行炮制。

232炮制前后薯蓣皂苷的变化分析取炮制前后两部分浸膏，HPLC检测薯蓣皂苷的变化情况。色谱条件：C18色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水梯度洗脱；检测波长：203 nm；柱温：35℃；流速：10 mL/min。见图1-5。

3结果讨论

黄精中甾体皂苷单体化合物薯蓣皂苷，经水合反应模拟炮制过程，通过提取分离和LC-MS、NMR结构鉴定，确定了HPLC图谱显示的薯蓣皂苷模拟炮制后新产生的两个单体化合物分别是延龄草苷和薯蓣皂苷元。可见经过炮制过程，结构不同的甾体皂苷发生了转化，薯蓣皂苷转化为次级苷和苷元。从药材方面分析，通过HPLC图谱比较，发现黄精饮片炮制前薯蓣皂苷含量很高，黄精饮片经炮制，炮制后薯蓣皂苷含量微弱，另外两种化合物延龄草苷和薯蓣皂苷元含量增大，说明薯蓣皂苷经炮制后转化成延龄草苷和薯蓣皂苷元。通过薯蓣皂苷单体模拟炮制前后变化与药材中薯蓣皂苷的炮制前后变化，证明在黄精炮制过程中甾体皂苷发生了转化，据此推测该化合物的变化可能与含薯蓣皂苷类中药材的药效和药效成分有相关。

[FL）][HJ2.45mm][SD1，1][FQ（21*3。175mm，X，DY-W][SQ+1mm][CD=175mm]

[KG（0.1mm]本研究建立了一种以化繁为简、模拟炮制、完全转化、规律分析的方法，以解毒增效为指征，从化学成分改变研究着手，通过HPLC图谱定性分析，验证了薯蓣皂苷在炮制过程中的变化规律。通过对薯蓣皂苷炮制前后主要甾体皂苷类化学成分变化的定性分析，基本明确了其变化规律，以黄精炮制前后物质基础的变化为重点，进一步验证药材中化学成分变化规律与实验结果预测相吻合。在今后甾体皂苷研究中，应注重转化产物生物活性及作用机制方面，明确药效部位，利用天然植物转化有效成分开发新药。与以往药材饮片炮制方法相比，本研究更能贴近与饮片炮制前后化学成分的真实变化情况，同时用单体进行模拟转化研究具有定向性、转化条件具有可控性、方法简单环保可行，进一步可产制加工一体化，为含甾体皂苷类中药材深度研究提供实践意义与理论参考。[KG）]

参考文献：

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