葛根调节脂肪细胞糖脂代谢改善胰岛素抵抗的研究お
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[摘要]该实验通过检测葛根对胰岛素抵抗（IR）3T3L1脂肪细胞葡萄糖消耗，甘油三脂（TG）含量及PPARγ，ADPN，GLUT4，LPL，FABP4，FASn表达量的影响来探讨葛根调节糖脂代谢改善脂肪IR的作用机制。先采用3T3L1前脂细胞诱导分化的成熟脂肪细胞，地塞米松诱导建立IR模型，将脂肪细胞分为正常组，IR模型组，罗格列酮阳性组，低、中、高剂量葛根含药血清组，以葡萄糖氧化酶过氧化物酶（glucose oxidaseperoxidase， GODPOD）法检测细胞培养液葡萄糖含量和甘油磷酸氧化酶（glycerol phosphate oxidase， GPOPOD）法测定胞内TG含量，荧光定量qPCR检测PPARγ，ADPN，GLUT4，LPL，FABP4（aP2），FASn基因mRNA水平。结果显示1 μmol・L-1 地塞米松作用3T3L1脂肪细胞96 h，与正常组比较，模型组葡萄糖消耗量降低（P
[关键词]葛根含药血清； 胰岛素抵抗； 3T3L1脂肪细胞； 糖脂代谢
葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata （Willd） Ohwi的干燥根，始载于《神农本草经》，具有解肌退热、透发麻疹、生津止渴、升阳止泻等功效。统计表明在改善胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）治疗2型糖尿病（type 2 of diabetes mellitus，T2DM）的临床用药中，葛根使用率位于第5位[1]。葛根具备清热燥湿凉血功效，可增强胰岛素敏感性。动物实验显示葛根改善ob/ob小鼠糖耐量和脂质代谢[2]。临床研究显示，葛根煎剂联合非诺贝特治疗高脂蛋白血症，能显著降低总胆固醇和甘油三酯（triglycerides，TG）含量，升高高密度脂蛋白水平，在改善高脂血症病人脂质水平上优于单用非诺贝特治疗[3]。除与西药联合治疗外，与葛根适当配伍的许多中药复方显示良好降糖效果，如葛根芩连汤复方在随机双盲临床实验降低空腹血糖和糖化血红蛋白，显示稳定降糖药效[45]。本课题组在均匀设计葛根芩连汤配伍动物实验中发现重用葛根配比能产生更优的降糖降脂药效。葛根的主要药效成分为异黄酮类化合物，包含葛根素、大豆苷元、染料木黄酮等，其中葛根素为葛根特有药效成分，研究已经证明，葛根素具有抗高胆固醇、抗炎、降血糖、神经保护等多种功效，临床实验显示葛根素可降低空腹血糖，促进β细胞分泌胰岛素[6]；动物实验显示其通过降糖，影响细胞信号通路，增加大鼠骨骼肌细胞膜葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter type 4，GLUT4）含量，改善IR[7]。深入研究葛根的调节糖脂代谢改善IR的机制可为葛根配伍的降糖降脂中药复方提供科学依据和理论基础。
血清药理学方法是公认中药复方体外细胞研究的可行性方法，本实验运用血清药理学研究方法，研究葛根含药血清（GeGen containing serum，GGCS）干预IR3T3L1脂肪细胞的降糖降脂药效，并在药效基础上检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferators activated receptor gamma，PPARγ），脂联素（adiponectin，ADPN），GLUT4，脂肪蛋白酶（lipoprotein lipase，LPL），脂转运结合蛋白4（fatty acid binding protein 4，FABP4）和脂肪酸合成蛋白（fatty acid synthase， FASn）表达水平，探讨葛根含药血清调节糖脂代谢改善3T3L1脂肪细胞IR的作用机制。
1材料
1.1动物SPF级雄性SD 大鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）201.20001。
1.2细胞株3T3L1小鼠前脂肪细胞株，购于美国ATCC，批号62.99684.7。
1.3药物葛根（野葛）购自江中饮片厂，批号1.5092.9，葛根素质量分数为5.5%，符合201.5年版《中国药典》标准。
1.4试剂葛根素（批号1.204），大豆苷元（批号1.502.200101）均购自四川省克奇生物科技有限公司；DMEM高糖培养基（Hyclone公司，批号NAE1.3.96）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，批号1.502.1.5）；新生牛血清（Life technologies公司，批号1.5.1.792.3）；3异丁基1甲基黄嘌呤（3isobutyl1methylxanthine，IBMX，批号1.5.879），地塞米松（批号82.2A05.2.1），胰岛素（批号Y0001.71.7），油红O干粉（批号5.2.2A05.2），罗格列酮（批号R2.408）购自Sigma 公司；葡萄糖测定试剂盒（南京建成生物有限公司，批号3.61.500）；甘油三脂测定试剂盒（南京建成生物有限公司，批号A1.101）；细胞裂解液（Cell Signaling Technolgy公司，批号9803）；Cell Counting Kit8 （同仁化学研究所，批号JH620）；PureLikeTM RNA Mini Kit（Life technologies公司，批号1.502.889A）；TRizol Reagent（Life technologies公司，批号74.1.2.1）；GoScriptTM Reverse Transcription System （Promega Corporation公司，批号00001.2.7670）；Power SYBR Green PCR Master Mix （Life technologies公司，批号1.4084.67）；NucleaseFree water（Qiagen Sciences公司，批号1.4.504.3.810）
1.5仪器岛津超高效液相色谱仪LC30A与三重四级杆质谱仪ABQTRAP5.500；倒置显微镜（Olymplus CKX4.1，Japan）；全波长酶标仪（Spectra Max Plus3.84， Molecular Devices，USA）；Nanodrop核酸蛋白检测仪（Invitrogen， USA）；实时荧光定量PCR（ABI7500，Life technologies，USA）。
2方法
2.1含药血清的制备SPF雄性SD大鼠40只，体重（300±20） g，适应性喂养5 d后，随机分组为空白组和葛根含药血清组。连续给药5次，每日相同时间给药2次，在第4次灌胃后禁食不禁水1.2 h后，最后一次给药1 h后，7%水合氯醛腹腔麻醉，无菌条件下腹主动脉取血。血样常温放置4 h，3 000 r・min-1离心1.5 min，取上清液，灭活、过滤除菌，-80 ℃保存备用。第1组：大鼠20只，按葛根2.5 g・kg-1/只灌胃制备葛根含药血清；第2组：大鼠20只，按同等条件灌胃等体积的生理盐水制备空白对照血清。
2.2葛根含药血清成分含量测定参照文献[8]方法制备血清样品，UPLCMS检测葛根成分含量，进样量2 μL。流动相5 mmol・L-1甲酸铵01%甲酸水（A）与乙腈（B），柱温3.5 ℃，梯度洗脱：0～1.5 min，10%～30% B；1.5～6 min，30%～40% B；6～8 min，40%～80% B；8～10 min，80% B；10～101 min，80%～10% B；10～1.3 min，10%B。葛根素和大豆苷元的检测离子对m/z分别为4.1.72/7969，2.5.5.1/1.990。
2.3.3T3L1前脂肪细胞培养及诱导分化成脂肪细胞参考文献[9] 方法，3.7 ℃，5% CO2的条件下，3T3L1前脂肪细胞置于含10%新生牛血清的高糖DMEM细胞维持培养基中，隔天更换新培养基，有利于细胞生长。待细胞融合2 d后，加入含有05 mmol・L-1 IBMX，1 μmol・L-1地塞米松，10 mg・L-1胰岛素，10%胎牛血清DMEM高糖培养基培养，4.8 h后换10 mg・L-1胰岛素，10%胎牛血清DMEM高糖培养基培养4.8 h，随后以10%胎牛血清DMEM高糖培养基继续培养，2 d换液一次，诱导分化8～1.2 d的3T3L1前脂肪细胞90%以上呈典型的“戒环状”脂肪细胞表型，油红O染色鉴定。
2.4建立地塞米松诱导IR3T3L1脂肪细胞模型参考文献[10] 方法，采用地塞米松诱导建立IR3T3L1脂肪细胞模型。正常组用10%胎牛血清DMEM高糖培养基，IR组用含1 μmol・L-1地塞米松和10%胎牛血清DMEM高糖培养基，采用GODPOD法分别检测2.4，4.8，72，96，1.20 h培养基上清液中葡萄糖含量，选择正常组和IR组细胞葡萄糖消耗量最大的时间为最佳时间，两者间差异有统计学意义作为建模成功依据。实验独立重复3次。
2.5分组及处理IR3T3L1脂肪细胞随机分为IR组、罗格列酮组、葛根含药血清组。正常组：未造模的3T3L1细胞，加入含1.5%空白血清培养液培养；IR组：造模后，加入含1.5%空白血清培养液培养；罗格列酮组：造模后，加入10 mg・L-1罗格列酮和1.5%空白血清培养液培养；不同浓度给药组：分别含5%，10%，1.5%葛根含药血清培养液，不足的血清以空白血清补足至1.5%。3.7 ℃，5% CO2培养给药干预2.4 h，收集上清液检测葡萄糖消耗量。
2.6细胞活性的测定按2.4项分组方案，给药干预2.4 h后，每组加上10 μL CCK8测定液，孵育4.5 min后，酶标仪检测4.50 nm吸光度，计算细胞存活率。细胞存活率= AIR组/A对照组×100%。
2.7培养液中葡萄糖含量及胞内TG含量检测以GODPOD检测每孔培养液中葡萄糖的含量，与未接种细胞的空白孔葡萄糖相减，计算葡萄糖消耗量（mmol・L-1）。以GPOPOD法测定细胞内TG含量，同时用BCA法蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度并对胞内TG数值进行校正，所得数值为TG浓度与细胞总蛋白浓度的比值，单位用mmol・μg-1表示。
2.8实时荧光定量PCR技术测定脂肪细胞PPARγ，ADPN，GLUT4，LPL，FABP4，FASn mRNA水平参考文献[11]的方法提取总RNA，RNA浓度及纯度用Nanodrop 2000核酸蛋白测定仪检测，确保吸光度在1.8～20，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定完整性。符合质控标准的RNA样本采用Promega逆转录试剂盒合成cDNA。
通过ABI公司提供的荧光定量PCR（Realtime quantitative PCR）引物设计软件Primer Premier 50分别设计βactin，PPARγ，ADPN，LPL，FABP4，GLUT4，FASN mRNA的PCR引物，以βactin作为内参基因。所设计的引物均来源于小鼠基因，具体序列见表1，引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
qPCR扩增反应体系：Power SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，正向引物1 μmol・L-1，反向引物1 μmol・L-1，cDNA 4 μL。qPCR实验参数：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性1.5 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，扩增40个循环，68～95 ℃建立熔解曲线，以βactin 为内参，用 2-ΔΔCt计算 mRNA 的相对表达量。
2.9统计方法所有数据以±s表示。组间差异比较用单因素方差分析（Oneway AVONA）及组间数据的比较采用t检验分析，由Graphpad prism 60统计软件完成并做图。P
3结果
3.1葛根含药血清成分含量测定葛根素出峰时间为3.4 min，质量分数为9787 mg・L-1；大豆苷元出峰时间为5.4 min，质量分数为3.97 mg・L-1。
3.2.3T3L1前脂肪细胞诱导分化及鉴定3T3L1前脂肪细胞在诱导分化前，与成纤维细胞相似，呈梭形或不规则的多角形，胞浆中未见脂滴；诱导分化后，细胞形态变圆，胞浆变亮，大量的脂滴集聚在细胞核周围，呈典型的“戒环样”结构，见图1。用油红O可将胞内脂肪特异性染成红色脂滴。
A3T3L1前脂肪细胞；B3T3L1脂肪细胞。
3.3地塞米松诱导IR3T3L1脂肪细胞模型的建立分化好的3T3L1脂肪细胞在1 μmol・L-1 DEX条件下培养1.20 h，分别检测2.4，4.8，72，96，1.20 h上清液中葡萄糖含量，其葡萄糖消耗量分别为1010%，2.75.4%，3085%，4.684%，3.1.76%。IR组葡萄糖消耗量低于空白组，随着培养时间的增加， 96 h时IR组降至4.684%，与空白组葡萄糖消耗量差值最大，差异非常显著（P
3.4细胞活力测定与正常组相比，IR组与葛根含药血清组在A4.50处的吸光度变化不大，无统计学意义，表明各剂量葛根含药血清对IR3T3L1 细胞活力无明显影响。与正常组相比，罗格列酮组细胞活力和细胞数量略有下降，对3T3L1细胞的生长有一定抑制作用（P
3.5葛根含药血清对IR3T3L1 细胞葡萄糖消耗量和胞内TG含量的影响分别测定给药干预1.2，2.4 h葡萄糖消耗量，IR组葡萄糖消耗量明显低于其他组，罗格列酮组和葛根含药血清组低于正常组；与IR组相比，葛根含药血清组上调IR细胞葡萄糖消耗量 （P
后，与IR组相比，阳性组罗格列酮TG含量显著下降（P
3.6葛根含药血清对IR3T3L1 脂肪细胞PPARγ，ADPN，GLUT4，LPL，FABP4，FASn mRNA表达的影响采用qPCR技术，检测IR3T3L1 脂肪细胞与糖脂代谢相关基因PPARγ，ADPN，GLUT4，LPL，FABP4，FASn mRNA表达水平，见图2。与IR组相比，葛根含药血清低剂量（5%）组上调PPARγ基因表达但差异不显著，罗格列酮组与葛根含药血清中剂量（10%）和高剂量（1.5%）组显著上调PPARγ基因表达（P
对于脂代谢相关基因，与IR组相比，罗格列酮组和高剂量（1.5%）葛根含药血清组显著上调细胞LPL 基因表达（P
4讨论
糖尿病是与胰岛素分泌缺陷或作用障碍所导致的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病，多数（>90%）是T2DM。IR是T2DM主要病理机制，作为T2DM发生发展的中心环节成为糖尿病研究热点[1.2.1.3]。T2DM患者中80%伴有肥胖，肥胖引起脂代谢紊乱诱发IR以抑制肝糖输出和促进脂肪组织和肌肉葡萄糖摄取的胰岛素功能受损为特点[14]。如何调节糖脂代谢提高胰岛素敏感性成为T2DM药
与IR组相比1）P
物研发的重点。
越来越多研究表明脂肪组织不仅是能量调节器官，也是内分泌器官。脂肪组织为IR的始发部位，当脂肪细胞分化失常引起脂肪过多堆积时，导致脂肪细胞内分泌功能紊乱，大量分泌的脂肪细胞因子和炎症因子通过各种途径影响胰岛素的生物学效应，可诱导肝脏和骨骼肌发生IR，最终发展为全身IR，因而脂肪IR在T2DM发生发展中起着非常重要作用[15]。加强药物干预脂肪IR的基础研究为糖尿病临床治疗提供理论基础和科学依据。
本实验选用野葛的葛根素质量分数为5.5%，符合《中国药典》规定（≥2.4%），葛根素是葛根质量分析的生物活性标记物，大豆苷元也有助于葛根的药理作用，均为异黄酮类物质，药代动力学显示葛根提取物异黄酮类成分口服后迅速吸收，输送至血液。本实验检测葛根含药血清葛根素和大豆苷元的含量，为用于体外研究的葛根含药血清建立质控标准。
本实验中使用1 μmol・L-1地塞米松诱导建立脂肪细胞IR模型，并在2.4～1.20 h检测IR组葡萄糖消耗动态变化， 结果发现IR组葡萄糖消耗量逐渐降低，在96 h时间点IR状态达到最佳，与张汝学等[16]研究相符。本实验正常组、模型组、阳性组、葛根含药血清中低剂量组均添加了空白大鼠血清，各组均使用1.5%大鼠血清，尽可能在实验设计上排除血清内源性因素对作用信号的影响。本研究发现葛根含药血清显著增加IR3T3L1细胞葡萄糖消耗量和降低胞内TG含量，并呈现剂量依赖性，提示葛根含药血清对IR脂肪细胞的糖脂代谢有明显改善作用。
在药效基础上，本研究进一步检测脂肪细胞胰岛素通路基因和糖脂代谢通路基因。鉴于PPARγ是脂肪细胞中唯一高丰度表达的核受体，与脂肪细胞分化、糖脂代谢及炎症反应关系密切，是噻唑烷二酮类（thiazolidinediones，TZDs）胰岛素增敏药物的主要作用靶点[17]。本研究选择TZDs药物罗格列酮作为阳性药物对照研究，结果显示 IR脂肪细胞PPARγ基因表达水平显著降低（P
ADPN是PPARγ基因直接调控的脂肪细胞因子，具有胰岛素增敏功能[18]。本研究观察到葛根含药血清均显著剂量依赖升高IR3T3L1 脂肪细胞ADPN基因表达，且与PPARγ基因表达趋势呈现一致性。本课题组前期在小檗碱干预3T3L1脂肪细胞研究中采用拮抗剂GW9662证实PPARγ和ADPN基因表达的内在关联[19]。临床研究表明携带PPARγ基因突变的IR患者ADPN水平是正常情况下的1/5，活化PPARγ增加脂肪细胞中ADPN的释放，诱导ADPN受体表达改善IR。机制研究表明PPARγ激活后，使ADPN水平上升，ADPN可通过磷酸化激活骨骼肌和肝脏的腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），从而刺激糖利用和脂肪酸氧化来增加胰岛素敏感性减轻IR，达到控制血糖治疗糖尿病的目的[20]。本实验提示葛根含药血清能激活脂肪细胞PPARγ表达上调ADPN改善IR，为葛根配伍治疗T2DM的方剂配伍提供理论基础。
在脂肪细胞糖代谢中，GLUT4是非常重要的葡萄糖转运蛋白，也是受核转录因子PPARγ直接调控的下游靶蛋白。葡萄糖跨膜转运的前提是GLUT4转位，在胰岛素或运动刺激下，脂肪细胞GLUT4会从细胞内转位至细胞膜上，在IR状态下，脂肪细胞外膜上的GLUT4减少，降低细胞对葡萄糖转运摄取引起脂肪IR，继而诱发糖尿病[21]。有相关研究显示，葛根素提高IR大鼠脂肪细胞GLUT4蛋白表达水平，使GLUT4转位至细胞膜增加，从而增强葡萄糖的摄取和利用[22]。本实验研究表明各剂量葛根含药血清组上调GLUT4基因表达，增加葡萄糖消耗改善脂肪IR。
除了调节重要糖代谢基因，PPARγ还可调控大量脂代谢基因表达，对脂肪细胞的脂代谢起着中心调控的作用。PPRE位于许多脂类代谢相关酶或蛋白基因的启动子位置上，PPARγ与PPRE元件相结合在转录水平上调节下游靶基因表达。如PPARγ可直接调控脂类代谢关键酶LPL基因在脂肪组织的表达，促使脂肪酸从脂蛋白上释放，调节脂肪细胞信号转导[23]。LPL可催化TG分解为甘油和游离脂肪酸（free fatty acid，FFA），其正常调控对机体向组织氧化供能至关重要。LPL结构和活性异常会导致脂代谢紊乱和血糖升高，与机体的脂肪沉积和代谢关系密切[24]。本研究结果表明，与IR组相比，葛根含药血清低剂量组LPL表达下调，中、高剂量组表达显著上调，低剂量葛根含药血清对细胞内TG的水解尚不明显，需中、高剂量作用下才能显著上调LPL基因表达来加强细胞氧化供能从而增强降脂作用。
本研究也检测中、高剂量葛根含药血清组上调FASn基因表达，且上调趋向于正常组。FASn在脂肪组织细胞中高度表达，参与细胞内源性脂肪的合成，主要产物是软脂酸，以TG形式存储能量来调节能量代谢。肥胖个体脂肪组织中FASn转录显著升高。有相关研究表明，在禁食肥胖个体中，皮下脂肪组织FASn基因表达减少会引起长期肥胖，在ob/ob小鼠实验中也出现了相同的情况[25]。故推测葛根含药血清可能促进内源FFAs转化为TG，降低脂毒性改善IR。
本研究也检测脂肪酸转运蛋白FABP4的表达。FABP4在脂肪细胞中协助脂肪酸转运和调节脂质代谢平衡等方面发挥着重要作用。Kim等发现非酒精性脂肪性肝病患者血清FABP4水平明显高于正常人，且总胆固醇，TG，空腹血糖，IR指数皆显著升高，FABP4与糖尿病的发生呈正相关[26]。本实验各剂量葛根含药血清能显著下调FABP4基因的表达，减轻脂质在细胞内的沉积。葛根干预LPL，FASn，FABP4基因与其他脂代谢基因共同维持脂肪细胞内脂质平衡，增强降脂作用减轻脂毒性改善IR。
综上所述，葛根含药血清通过增加IR脂肪细胞葡萄糖摄取和降低胞内TG含量，推测其改善脂肪IR机制部分是通过激活PPARγ和ADPN及重要糖脂代谢靶基因GLUT4，LPL和FASn基因表达，下调FABP4基因表达。这些基础研究有助于运用葛根治疗糖尿病的复方配伍优化提供理论基础和科学依据。
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