基于脂质代谢组学研究褐藻糖胶对黄颡鱼幼鱼的影响
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摘 要 采用超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱 （UPLCQTOFMS） 技术，结合多元变量数据分析方法，研究0.1%褐藻糖胶喂养黄颡鱼幼鱼1～8周的脂质代谢组学。通过不同喂养时间的黄颡鱼脂质成分的重要性（VIP）值和差异性（P）值，筛选出98个差异性代谢物，其中鉴定出与褐藻糖胶对黄颡鱼随喂养时间变化的影响有重要作用的11种脂质生物标志物，包括LysoPC 16∶0、PC 22∶6/16∶0、PE 22∶6/16∶0、PI 18∶0/22∶6、DAG 16∶0/16∶0、DAG 16∶0/18∶1、DAG 18∶1/18∶1、TAG 20∶5/16∶0/18∶3、TAG 20∶4/16∶1/18∶2、TAG 16∶0/18∶2/20∶5 和TAG 18∶2/14∶0/18∶1。研究表明，经0.1%褐藻糖胶喂养不同时期的黄颡鱼中LysoPC、PC、PE和PI的含量在第8周时达到最大值； DAG的含量呈现出先减少后增加的变化规律，而TAG的变化不定，TAG 18∶2/14∶0/18∶1、TAG 20∶5/16∶0/18∶3和TAG 20∶4/16∶1/18∶2的含量随着喂养褐藻糖胶时间的延长而增加，而TAG 16∶0/18∶2/20∶5呈减少的趋势。根据上述实验结果，推测褐藻糖胶可能通过调节脂质成分的含量来增加黄颡鱼幼鱼的免疫力。本研究结果为褐藻糖胶对黄颡鱼脂质代谢响应机理的影响的研究提供理论依据。
关键词 黄颡鱼； 褐藻糖胶； 超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱； 脂质组学
1 引 言
黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）肉质细嫩，含有大量粗蛋白、矿物元素、必需氨基酸及维生素E，且药用价值高，因而成为备受人们喜爱的优质食用鱼[1，2]。然而，在自然生长条件下，黄颡鱼体内出现大量的脂肪积累，从而导致鱼体可食部分减少及食用价值下降，甚至可能引起脂肪肝发生病变[3～5]。研究表明，在饲料中添加适量植物多糖可改善鱼体内脂质代谢，提高鱼体品质[6]。Yang等[7]发现在饲料中添加0.1%褐藻糖胶（Fucoidan）能显著促进黄颡鱼幼鱼的生长，提高胃和肠道中脂肪酶活性。褐藻糖胶具有降血脂、抗氧化、调节免疫系统、抗凝血、抗肿瘤等活性[8，9]，还可以促进胃肠蠕动，降低胆固醇及甘油三酯含量，加速肠道内多余胆固醇及有害重金属的排出，对肝脏无毒害作用。因此，了解黄颡鱼幼鱼体内脂质代谢在褐藻糖胶影响下的变化，对提高黄颡鱼幼鱼免疫力和黄颡鱼食用品质具有重要意义。
脂质组学作为代谢组学的一个分支，对所有脂类物质进行系统研究[10～12]。具有高分辨力的超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱（UPLCQTOFMS）技术，是复杂生物代谢物的脂质组学分析中应用最广泛的分析技术[13～17]。本研究采用UPLCQTOFMS技术，结合多元统计变量分析方法，进行黄颡鱼幼鱼在喂养0.1%褐藻糖胶不同时间下的脂类代谢组学研究，为黄颡鱼健康养殖提供基础数据。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
超高效液相色谱分析系统QTOF Premier高分辨四级杆飞行时间串联质谱联用系统（美国Waters公司）； ACQUITY UPLC BEH C8色谱柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm，美国Waters公司）； XS105分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）； 38K台式高速冷冻离心机（德国Sigma公司）。乙腈、甲醇、氯化锂、甲酸（色谱纯，美国SigmaAldrich公司）。
2.2 样品前处理
黄颡鱼幼鱼购于浙江嘉兴一星公司养殖基地，禁食24 h后取w重相近、健康情况相近的黄颡鱼幼鱼进行实验并将其分组。每组5个重复，每个重复30尾，以重复为单位饲养于体积为500 L的圆柱形塑料桶中。饲喂在普通饲料中添加0.1%褐藻糖胶的饲料的为实验组，实验周期为8周。分别于喂养1、2、4和8周4个时间点取样，每个时间点分别取出10尾，作为10个平行样。经超低温冷冻干燥且液氮冰浴研磨后，于
Symbolm@@ 80℃保存，备用。
总脂的提取采用BlighDyer法[18]并做适当改良：取（50 ± 0.1） mg样品于15 mL玻璃离心管中，加入5 mL甲醇氯仿（1∶1，V/V）振荡提取5 min，再超声10 min后，3500 r/min离心10 min，重复操作3次，合并上清液，于27℃下旋转蒸发至恒重； 加2 mL甲醇冲洗旋蒸瓶，转移至4 mL样品瓶中，氮气吹干； 用1 mL甲醇复溶后，12000 r/min离心10 min，经0.22 μm有机滤膜（美国Millipore公司）过滤后，待测。
2.3 UPLCQTOFMS分析条件
2.3.1 色谱条件 流动相A为乙腈四氢呋喃异丙醇（1∶1∶1，V/V），流动相B为乙腈水（2∶1，V/V），A和B中均加入0.1%（V/V）甲酸和0.01%（m/V）LiCl。洗脱梯度：0～3 min， 2% A； 3～5 min，2%～30% A； 5～12 min，30%～50% A； 12～22 min，50%～80% A； 22～25 min， 80% A； 25～27min，80%～2% A； 27～30 min，2% A。流速为0.5 mL/min，进样量为3 μL。柱温箱温度40℃。
2.3.2 质谱条件 离子源温度为120℃，脱溶剂温度为250℃，脱溶剂气（氮气）流速为600 L/h。四极杆质谱仪质量扫描范围m/z 100～1200，一次扫描时间为0.3 s。TOF质谱仪离子飞行方式采用V模式，m/z 1000时最大分辨率调整为10000。在正离子电离模式下，毛细管电离电压3.0 kV，取样锥孔电压为35 kV； 在负离子电离模式下，毛细管电离电压为2.6 kV，取样锥孔电压为45 kV。用于MSE分析时碰撞能量在低能量（25 eV）和高能量（50 eV）间转换。仪器测定，用甲酸钠进行多点矫正，并用0.5 ng/μg亮脑啡肽作为外标物对目标离子进行精确质量锁定。
2.4 数据处理
LCMS的原始数据通过Masslynx V4.1 数据处理系统（美国 Waters公司），获得包含样品名称、每一样品基于保留时间和对应质荷比的峰数量和归一化后的峰强度数据表。剔除丢失80%数据峰，并将归一化峰面积最小非零值的一半代替未检测到的数据[17]，导入SIMCAP 13.0 （Umetrics， Umea， Sweden）进行多元统计变量分析。经Log转换，在Pareto模式下进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法辨别分析（PLSDA）。通过MEV软件（Version 4.5.1）的KruskalWallis检验潜在标志物在单因素分析水平上是否存在显著性差异（p
3 结果与讨论
3.1 不同时期黄颡鱼幼鱼的脂质组学分析
将喂养0.1%褐藻糖胶1、2、4和8周（分别用F1、F2、F3和F4表示）的黄颡鱼幼鱼脂质提取物进行UPLCQTOF MS分析。将质谱数据峰进行归一化处理，导入SimcaP数据软件，分别进行PCA及PLSDA分析。PCA能将多变量、多主成分（PC）的大数据降维分析，PCA得分矩阵图是由第一主成分和第二主成分构成的平面投影平面图（D1A和1B）。PLSDA作为一种监督式投影方法，通过七折交叉验证使F1F4组的样品在数据集中实现最大分离（图1C和1D）。在正离子模式下， R2Y=0.980，Q2=0.867； 在负离子模式下，R2Y=0.987，Q2=0.904。Q2为累积价差有效性，Q2越大，表示模型的预测能力越好； R2为累积方差值，表示有多少原始数据被用于建立新的PLSDA判别模型，R2越大，表示解释能力越强，这说明在F1F4组的PLSDA模型预测能力和解释能力较好。将此模型经200次排列实验，得到正离子模式R2 截距为0.381，Q2 截距为0.271 ，负离子模式下R2截距为 0.285，Q2 截距为0.227。上述结果与文献[19]报道数值相符，即R2 截距< 0.4； Q2 截距< 0，说明PLSDA模型均能较好拟合，没有出现过拟合现象。此外，根据PLSDA模型和KruskalWallis检验分别获得物质的VIP值和p值，筛选出98个VIP>1且p< 0.05的差异性代谢物。
3.2 脂质生物标志物的鉴定
通过比较各类脂质标准品的保留时间（RT）、元素组成模拟及特征碎片离子（误差< 5 ppm），并结合文献报道的部分种类脂质的碎片模式，如PC，PE，PS，PI，TAG，DAG[15，20～22]，对98个差异性代谢物进行鉴定。为了进一步确定脂质的可能结构，通过LIPID MAPS库（）、LIPID BANK库（www.lipidbank.jp）、METLIN库（metlin.scripps.edu）、LIPIDOMICS EXPERTISE PLATFORM库（www.lipidmoicsexpertis.de）及HMDB库（www.hmdb.ca）在线数据库搜库确认。最终在正、负离子模式下鉴定出与褐藻糖胶对黄颡鱼随喂养时间变化的影响有重要作用的11种脂质标志物，如表1所示。
3.3 喂养0.1%褐藻糖胶对黄颡鱼幼鱼脂质影响的分析
随着喂养0.1%褐藻糖胶时间的变化，黄颡鱼体内的脂质代谢组也发生改变。如图2所示，热图中不同的颜色代表不同的脂质含量水平：红色表示脂质含量相对高，绿色表示脂质含量相对低。鉴定的TAG 18∶2/14∶0/18∶1[BHDFG5，WKZQ0W]LysoPC，溶血磷脂酰胆碱； PC，磷脂酰胆碱； PE，磷脂酰乙醇胺； PI，磷脂酰肌醇； DAG，甘油二酯； TAG，甘油三酯。
11种脂质标志物中，LysoPC 16∶0和 PI 18∶0/22∶6含量在饲喂褐藻糖胶最初的几周变化不明显，而在第8周时含量增加； PC 22∶6/16∶0的含量是先增加后下降，但是在第8周时达到最高值； PE 22∶6/16∶0在这4个时间点中，变化不是很明显，在喂养一段时间后，含量略有升高。此外，与第1周相比，DAGs（16∶0/16∶0，16∶0/18∶1，18∶1/18∶1）含量在第2周和第4周时逐渐减少，到第8周开始回升； 与前4周相比，4种TAG在第8周时有明显变化，其中TAG 18∶2/14∶0/18∶1、TAG 20∶5/16∶0/18∶3和TAG 20∶4/16∶1/18∶2的含量随着褐藻糖胶喂养时间的延长而增加，而TAG 16∶0/18∶2/20∶5则随着喂养时间的延长而含量减少。为了更直观地表示各个脂质标志物的含量变化，利用各个时间点下的归一化面积进行箱式图分析，如图3所示。
PC和PE在维持细胞结构和脂质代谢中发挥着重要作用，PC可显著提高大脑性能，加速神经元间的信号传导[22]，PE在动物磷脂中含量位列第二，大脑中含量最高，在哺乳动物细胞的细胞质分裂过程中发挥了重要作用[23]。PI是重要的信号分子，参与“双信使系统”[24]。因此，黄颡鱼幼鱼中LysoPC 16∶0，PC 22∶6/16∶0，PE 22∶6/16∶0及PI 18∶0/22∶6的变化趋势虽不同，但是在喂养到第8周时含量均增高，这与细胞膜的结构和性能密切相关。此外，各种类TAG中，有的TAG含量增加，有的TAG减少，而DAG的含量则是先减少再增加。Yang[7]和吴清和[25]等发现，褐藻糖胶通过刺激相关的脂肪酶来影响TAG含量，如激素敏感性脂肪酶（HSL）可水解单酰甘油（MAG）、DAG、TAG等[26]，脂蛋白脂肪酶（LPL）可水解血浆脂蛋白中的TAG，从而分别为脂肪及其它组织提供可储存和氧化的游离脂肪酸（FFA），是鱼体内重要的调节脂肪含量的酶[28]。其它相关酶还包括磷酸化激素敏感性脂肪酶（pHSL）等，在上述酶的作用下，黄颡鱼体内有的TAG水解为FA，且多为不饱和脂肪酸。高含量的不饱和脂肪酸能促进鱼类的生长、脂质代谢及提高其免疫能力，亦可通过
SymbolbA@ 氧化作为细胞能量的来源[29]。在幼鱼生长过程中，需要积累一定的脂肪来提高自身的免疫力，因此TAG脂质标志物呈现出不同的变化规律，TAG 18∶2/14∶0/18∶1、TAG 20∶5/16∶0/18∶3和TAG 20∶4/16∶1/18∶2的含量随着褐藻糖胶喂养时间的延长而增加，而TAG 16∶0/18∶2/20∶5含量则随着喂养时间的延长而减少。在脂质生物合成过程中，DAG作为TAG合成的中间分子，且在信号转导通路中作为脂质信使发挥作用，可为膜提供负曲率，因此DAG是包括膜磷脂和TAG在内的细胞甘油酯完整系列的前体分子[30]。正是因为DAG功能的高度多样化，其在脂质代谢中的作用也非常复杂，因此DAG的含量的变化也呈现多样化的趋势。
4 结 论
利用UPLCQTOFMS和多变量数据分析手段，研究了饲喂0.1%褐藻糖胶不同时间下黄颡鱼幼鱼的脂质代谢组学，共鉴定出11种差异性脂质代谢标志物，在第8周时变化最显著； 其中LysoPC、PC、PE、PI和DAG在第8周时含量最高，而TAG未呈现明显的变化规律，DAG具有先减少后增加的趋势。结果表明，褐藻糖胶通过调节黄颡鱼幼鱼的脂质代谢而影响其生长及免疫功能。本研究结果为研究褐藻糖胶对黄颡鱼养殖的作用机制提供了参考。
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