列当中苯乙醇苷类成分的含量测定
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[摘要] 列当为列当科中重要的药用植物。该研究建立了列当中主要活性成分毛蕊花糖苷和crenatoside，以及总苯乙醇苷类化合物含量测定的方法，并测定15个列当样品中上述成分的含量，对其资源利用价值进行评价。研究采用高效液相色谱法测定列当中毛蕊花糖苷和crenatoside的含量，紫外分光光度法测定总苯乙醇苷的含量。结果显示列当中含量最高的成分是毛蕊花糖苷，其次为crenatoside；15个样品中毛蕊花糖苷、crenatoside和总苯乙醇苷的含量差异较大，毛蕊花糖苷的含量在1.15%～15.60%，crenatoside 在0.83%～4.47%，总苯乙醇苷在6.78%～27.43%。采集时间对药材主要成分含量影响较大，盛花期采集的列当，苯乙醇苷类成分含量较高。结果表明2种含量测定方法操作简便、准确、重复性良好，可用于评价列当药材的质量以及资源利用价值。
[关键词] 列当；高效液相色谱法；毛蕊花糖苷；crenatoside；苯乙醇苷；含量测定
[Abstract] Orobanche caerulescens is an important medicinal resource in Orobanchaceae. The present study aims to establish methods for determination of acteoside， crenatoside， and total phenylethanoid glycosides in O. caerulescens， and determine the content in 15 samples to evaluate the resource utilization of this medicinal plant. The content of acteoside and crenatoside were quantitatively determined by HPLC， while total phenylpropanoid glycosides was estimated by UV-VIS spectrophotometry. According to the results， the content of acteoside was the highest in O. caerulescens， followed by crenatoside. The contents of acteoside， crenatoside， and total phenylethanoid glycosides were between 1.15%-15.60%， 0.83%-4.47%， and 6.78%-27.43%， respectively， which had significant differences. The acquisition time has great influence on the content of main components of O. caerulescens. The content of phenylethanoid glycosides is higher in the samples which were collected at the flowering stage. The two determination methods were proved to be simple， accurate and reliable， and can be used to evaluate the quality and resource utilization of O. caerulescens.
[Key words] Orobanche caerulescens； HPLC； acteoside； crenatoside； phenylethanoid glycosides； determination
doi：10.4268/cjcmm20152119
列当Orobanche caerulescens Steph.为列当科列当属药用植物，别名紫花列当、兔子拐棍、独根草，为寄生草本，内蒙古自治区各地分布，东北、华北、西北等地也有分布[1-2]。列当全草药用，有补肾助阳、强筋骨、润肠的功效，主治阳痿、腰腿冷痛、神经官能症及小儿腹泄等，外用可消肿。蒙药名为特木根-苏乐，主治炭疽[3-4]。列当是列当科重要的药用植物，国内外学者的研究表明苯乙醇苷类化合物是其特征性化学成分[5-7]。苯乙醇苷类化合物（phenylethanoid glycosides），是由一个C-6-C-3单元衍生出的取代苯乙醇为苷元的苷，特点是与苯乙醇成苷的中心葡萄糖常被芳香酰基取代，通常为咖啡酰基取代，因此，也被称为咖啡酸酯类（caffeoyl esters）。苯乙醇苷类化合物也是列当科著名中药肉苁蓉的主要成分[8-10]，具有抗氧化、清除自由基、神经保护、增强学习记忆、抗病毒、强心等明显的生理活性[11]。
目前国内外关于列当中化学成分的含量测定未见报道。课题组的研究表明毛蕊花糖苷和crenatoside是列当中含量最高的苯乙醇苷类化合物。文献报道毛蕊花糖苷具有很强的生理活性，主要包括增强学习记忆、抗骨质疏松、肝脏保护、杀菌、免疫、补肾壮阳、抗氧化、抗衰老等多种药理活性[12-19]。有关crenatoside药理活性的研究相对较少，仅发现其具有清除DPPH（1-二苯基-2-三硝基苯肼）的活性，表现出显著的抗氧化作用。
本研究分别建立了高效液相色谱法测定列当中毛蕊花糖苷和crenatoside，以及紫外分光光度法测定总苯乙醇苷类化合物含量的方法，采集内蒙古各地15批样品并进行测定，结果表明2种测定方法可用于列当药材的质量控制，为其资源的进一步开发利用提供了科学依据。
1 材料
1.1 仪器
UltiMate 3000型高效液相色谱仪（DAD检测器，四元梯度泵，在线脱气机，自动进样器，chromeleon色谱工作站，Thermo Fisher）；TU-1901双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器公司）；AL240分析天平（梅特勒-托利多仪器厂）；KQ-500DE超声仪（昆山市超声仪器厂）。
1.2 试剂
毛蕊花糖苷和crenatoside为实验室自制，经MS，H1-和C13-NMR确定结构，HPLC峰面积归一化法测得纯度均大于98%，乙腈（美国Fisher公司，色谱纯），水为娃哈哈纯净水，其他均为分析纯。
1.3 药材
列当药材为内蒙古各地采集，经内蒙古医科大学王素巍讲师鉴定为列当O. coerulescens的全草。
2 方法与结果
2.1 HPLC测定毛蕊花糖苷和crenatoside的含量
2.1.1 色谱条件 Inertsil ODS-RP HPLC色谱柱（4.6 mm ×250 mm， 5 μm）；流动相为乙腈-0.l%磷酸水溶液（22∶78）；检测波长为330 nm；柱温30 ℃；流速1 mL・min-1，进样量10 μL，色谱图见图1。
2.1.2 对照品溶液制备 取减压干燥至恒重的对照品适量，分别精密称定，加入甲醇溶解制成每1 mL含毛蕊花糖苷0.52 mg，crenatoside 0.53 mg的对照品溶液A、B，精密吸取A、B对照品溶液各1.0 mL，置5 mL量瓶中，甲醇定容，制备成混合对照品溶液C。保存于4 ℃的冰箱，备用。
2.1.3 供试品溶液制备 列当粉末（过40目筛）约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇溶液25 mL，称定质量，浸泡1 h后，超声（功率500 W，频率40 kHz）提取30 min，冷却后补足失重，摇匀，静置，滤过，取续滤液即得。
2.1.4 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品C溶液1，2，5，10，20，30 μL以及单一对照品A溶液10，12，16 μL注入液相色谱仪，测定，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。结果表明毛蕊花糖苷在0.104～8.320 μg线性关系良好， 回归方程为Y=20.056X-0.483，r=0.999 9；crenatoside 在0.106～3.180 μg线性关系良好，回归方程为Y=20.182 X+0.025，r=1.000 0。
2.1.5 精密度试验 精密吸取供试品溶液，连续进样6次，记录色谱峰面积。结果毛蕊花糖苷，crenatoside峰面积的RSD分别是0.23%，0.39%，表明仪器精密度良好。
2.1.6 重复性试验 取同一份供试样品粉末6份，精密称定，按2.1.3项下方法平行制备供试品溶液，连续进样，记录色谱峰面积。 结果毛蕊花糖苷、crenatoside峰面积的RSD分别为1.0%，1.3%，表明该方法重复性良好。
2.1.7 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液，分别在样品制备后的0，2，4，6，8 h内进样5次，记录色谱峰面积。结果毛蕊花糖苷、crenatoside峰面积的RSD分别为0.28%，0.69%。表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。
2.1.8 加样回收率试验 取已知含量的列当样品（表3，12号）粉末（毛蕊花糖苷99.2 mg・g-1，crenatoside 29.7 mg・g-1） 9份，每份约0.05 g，精密称定，分别按该样品中待测成分含量的80%，100%，120%，精密加入2个对照品适量，按2.1.3项下方法制备供试品溶液，进样测定并计算各成分平均加样回收率及RSD，见表1。
2.1.9 样品含量测定 按2.1.3项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积并计算2种成分的含量，见表2。
2.2 紫外分光光度法测定总苯乙醇苷的含量
2.2.1 毛蕊花糖苷对照品溶液制备 精密称取毛蕊花糖苷对照品10.7 mg，用70%甲醇溶解并定容于50 mL量瓶中，得到0.214 g・L-1的标准溶液。
2.2.2 供试品溶液制备 取列当粉末约0.1 g，精密称定，置于100 mL锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，称重，室温浸泡1 h，超声提取40 min，补足失重，过滤，精密吸取滤液0.5 mL，置于25 mL量瓶中，用70%甲醇定容，即得。
2.2.3 最大吸收波长选择 分别吸取适量对照品溶液和供试品溶液于25 mL量瓶中，用70%甲醇定容，以70%甲醇为空白对照，于200～500 nm波长范围内扫描，在332 nm处得到最大吸收波长，选择332 nm为测定波长，见图2。
2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取毛蕊花糖苷标准溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL置于25 mL量瓶中，并用70%甲醇定容，以70%甲醇为空白对照，在332 nm处测定吸光度A。结果表明毛蕊花糖苷对照品在4.28～25.68 μg・mL-1内线性关系良好，回归方程为Y =0.033 1X + 0.000 1，r=0.999 8。
2.2.5 重复性试验 精密称取6份列当粉末各约0.1 g，按2.2.2项下方法平行制备供试品溶液6份，测定总苯乙醇苷含量，RSD为2.2%，说明本方法重复性良好。
2.2.6 精密度试验 取同一供试品溶液，连续6次测定其在332 nm处吸光度，计算得RSD 0.21%，结果表明该方法精密度良好。
2.2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0，1，2，4，8，12 h在332 nm处进行紫外测定，RSD为1.1%。表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。
2.2.8 加样回收率试验 取已知含量的列当样品（表3，12号）粉末9份（n=3），各约0.05 g，精密称定，分别按已知总苯乙醇苷含量的 80%，100%，120% 3个水平加入毛蕊花糖苷对照品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，在332 nm处测定吸光度，计算平均回收率和RSD，见表3。
2.2.9 总苯乙醇苷含量测定 按2.2.2项下制备供试品溶液，以70%甲醇为空白对照，在332 nm处测定吸光度，并采用标准曲线法计算含量，结果见表2。
3 结论
列当中的主要成分是苯乙醇苷类成分，包括毛蕊花糖苷、crenatoside、异毛蕊花糖苷、和campneoside Ⅱ等，其中含量最高的2个成分是毛蕊花糖苷和crenatoside。
通过对15个批次不同采集地点以及不同采收时间的列当中苯乙醇苷成分的含量测定结果表明，毛蕊花糖苷、crenatoside和总苯乙醇苷的含量差异较大。毛蕊花糖苷的质量分数在1.15%～15.60% （样品10含量低于线性范围），crenatoside在0.83%～4.47%，总苯乙醇苷在6.78%～27.43%。研究中发现内蒙古东、中、西部不同地区产的药材的含量变化不是很明显。影响药材中苯乙醇苷成分含量的主要因素是采集时间。传统认为，列当药材应在6月份盛花期采集，质量好，研究亦证实了这一点，有的药材采集于盛花期，其总苷和毛蕊花糖苷含量极高，超出线性检测范围。样品（2，6，7，10，14， 15）采集时几乎在8月份，地上部分已全部枯萎，药材颜色发黑，其苯乙醇苷类成分含量较低。
4 讨论
本研究建立了HPLC同时测定列当中毛蕊花糖苷和crenatoside的方法，方法简便、准确且重复性好，为系统评价列当的质量提供科学依据。在方法建立过程中，对成分的检测波长，色谱流动相条件、流速、柱温以及苯乙醇苷类成分的提取条件都做了考察，确定流动相为乙腈-0.l%磷酸水溶液（22∶78）；检测波长为330 nm；柱温30 ℃；流速1 mL・min-1；进样量10 μL，在这个色谱条件下，毛蕊花糖苷、crenatoside能达到很好的基线分离；且进样量分别在0.104～8.32 μg （r=0.999 9），0.106～3.18 μg （r=1.000 0）与峰面积呈良好线性关系；平均加样回收率（n=3）分别为101.9%和96.78%；精密度和重复性试验的RSD（n=6）均小于3%。提取条件最终确定为称取0.1 g药材，加70%甲醇浸泡1 h超声30 min，能使待测成分最大限度的检出。本方法操作简便，精密度、重现性良好，结果准确可靠，可用于列当药材的质量控制以及资源利用研究。
分光光度法是测定中药和天然药物中一类成分总含量的常见方法。本研究建立了紫外分光光度法测定列当总苯乙醇苷含量的方法。研究选定药材中含量极高的毛蕊花糖苷作为对照品，对照品溶液和样品溶液经全波长扫描，均在332 nm处有最大吸收。对照品毛蕊花糖苷化合物在4.28～25.68 mg・L-1具有良好的线性关系（r=0.999 8）。该法具有操作简便快捷、设备要求低、稳定性和重现性好等优点。
研究发现，苯乙醇苷类化合物集中存在于唇形目（唇形科、马鞭草科）和玄参目（玄参科、列当科、苦苣苔科、爵床科、车前科、紫葳科），表现出该类成分与分类系统密切相关。该植物类群中许多著名的传统中药如清热解毒药（地黄、玄参、连翘），补虚药（肉苁蓉、女贞）都含有这类成分。同时，这类化合物结构相似，生物活性很强，具有良好的医疗价值。列当中苯乙醇苷含量很高，尤其是毛蕊花糖苷的含量，此研究结果为评价和利用列当资源提供了重要科学依据。
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