针对注射用头孢替唑中细菌内毒素的检测研究
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[摘 要]目的：建立快速的注射用头孢替唑细菌内毒素检查法，替代热原检查法。方法：用不同厂家的鲎试剂对不同批号的注射用头孢替唑分别进行干扰试验，考察确立注射用头孢替唑的内毒素检查法。结果：将注射用头孢替唑稀释至1.25 mg・mL-1以下可消除干扰作用，结果准确可靠。结论：注射用头孢替唑可以用细菌内毒素检查法取代热原检查法。
中图分类号：S261 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）16-0353-01
头孢替唑属于新型的头孢类药物，是国家近几年新研制成功的第四代头孢类药物，该药物最显著的优势就是抗菌谱广，通常被应用在败血症中，除此之外，还用于治疗呼吸系统感染疾病，在临床治疗中，也被应用在泌尿系统感染疾病等。虽然头孢替唑临床应用经验比较多，但是将其注射用头孢替唑的细菌内毒素的检测研究案例却不常见，本文将头孢替唑以粉针剂的形式来对细菌内毒素进行检查。传统的检查方法使用的热原检查方法，但是这种检查方法劣势比较多，因此以细菌内毒素检查方法来替代，以此来验证使用头孢替唑的安全可靠性。
一、材料
微量取液器（上海金林生化试剂仪器厂）；SW-80A型旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）；细菌内毒素检查用水（批号20121024，规格每支2mL，厦门鲎试剂实验厂）；细菌内毒素标准品（批号20120413，规格每支10EU，厦门鲎试剂实验厂）；鲎试剂（批号20120908，规格0.125EU・mL-1，厦门鲎试剂实验厂；批号20121207，规格0.5EU・mL-1，厦门鲎试剂实验厂；批号20121015，规格0.125EU・mL-1，湛江安度斯生物有限公司）；细菌内毒素检查用具（厦门鲎试剂实验厂）；注射用头孢替唑（每瓶1.0g，天津新丰制药有限公司，批号20120608，20120923，20121207）。
二、方法与结果
1、鲎试剂灵敏度（λb）复核
鲎试剂灵敏度复核[1]：将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15min，然后制成1.0，0.5，0.25，0.125EU・mL-1的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30s。每一浓度平行做4支，每管加入待复核的鲎试剂0.1mL和内毒素标准溶液0.1mL。同时用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管，共18管，轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入（37±1）℃适宜恒温器中，保温（60±2）min，结果0.5λb
2、初筛试验
2.1内毒素限值（L）的确定，每小时人体可以接受的最大内毒素剂量为（5EU・kg・h-1）×60=300EU・h-1（人平均体重按60kg计算）；而注射用头孢替唑人用每次最大剂量为4g，溶于5%葡萄糖注射液中2h滴注完毕，葡萄糖注射液的内毒素限量为0.5EU・mL-1，葡萄糖注射液按每1h200mL输入人体计算，则葡萄糖注射液带入的内毒素最大量为100EU・h-1；故注射用头孢替唑允许带入的内毒素最大限量为300-100=200EU・h-1。因为注射用头孢替唑每1h注入人体量为2000mg，所以注射用头孢替唑内毒素限量为0.1EU・mg-1。
2.2样品最大有效稀释浓度（cMVD） 以鲎试剂灵敏度0.5EU・mL-1为基准，以cMVD=λ/L=0.5/0.1=5.0mg・mL-1为样品的基准稀释浓度，用细菌内毒素检查用水以基准稀释浓度为起点，将样品往下倍比稀释，得样品的浓度系列溶液，即5.0，2.5，1.25，0.6，0.3mg・mL-1，记此系列溶液为NPC系列。PPC系列：将样品稀释成与上述NPC系列相同浓度系列，但在稀释过程中每一浓度样品都含有2λb内毒素。采用灵敏度λb=0.5EU・mL-1的鲎试剂分别与NPC和PPC2个系列的样品反应（37℃，60min）结果见图1。结果表明：样品浓度为1.25mg・mL-1以下时，不干扰实验进行。
3、干扰试验
选择样品实验浓度为1.25mg・mL-1，即内毒素限值为0.125EU・mL-1。其初筛试验结果如图1：
选取灵敏度λb=0.125EU・mL-1的鲎试剂，将样品用细菌内毒素检查用水稀释至浓度为1.25mg・mL-1做干扰试验。干扰试验按中国药典2000年版细菌内毒素检查法的供试品干扰试验项进行，实验结果见表2。结果表明：0.5λb
4、样品细菌内毒素检查
取3批热原检查合格的注射用头孢替唑（每批各取5支）分别用细菌内毒素检查用水稀释至1.25mg・mL-1，使用λb=0.125EU・mL-1的鲎试剂按中国药典2000年版细菌内毒素检查法检查，结果全部呈阴性。
三、讨论
首先，在正常情况下，标准规定要求，检测头孢替唑中细菌内毒素通常使用家兔法，以此来控制热原，但是因为这种操作方法并不简单，比较复杂，在实验过程中会受到诸多因素的影响，所以实验结果难以得到保证，此外，采用家兔控制热原的方法，还需要耗费大量的时间，这对实验的深入研究十分不利，因此实验人员最终选择使用鲎来进行试验，这种实验方法不仅操作工艺不复杂，而且节省大量的时间，最为重要的事灵敏度非常高，实验结果可以保证。
其次，在试验期间还需要考虑到细菌内毒素限值问题，因为正是有限值问题的存在，使得葡萄糖注射液具备加和的性质，所以为了确保是结果真实可靠，需要明确其限值，使其符合实验要求。
再次，本试验主要分为两部分，一部分是初筛实验，另一部分是干扰试验，之所以要分为两部分，主要是为了保证实验结果的真实可信。实际上，初筛实验可以被看作是一种预实验，其试验结果并不能作为最终结果，而且需要经过干扰试验进行严格详细的验证。之所以要进行初筛实验，其主要目标是为了作出合理的评价，试验不同的样品浓度，对鲎试剂以及内毒素产生的不同干扰程度，或者两种物质在样品中，会产生哪种干扰性质等，并且以此为标准，筛选出适当范围的样品浓度，并且中筛选出与之相相应的鲎试剂灵敏度，这样在进行干扰试验时，不必耗费大量的时间来进行筛选，同时也能够充分的利用鲎试剂。在初筛试验中，发现样品对细菌内毒素干扰性质十分显著，主要以抑制作用的方式呈现，当样品浓度范围保持在低于1.25mg・mL-1时，该样品对鲎试剂不会产生任何的干扰影响，因此对于鲎试剂来说，样品的有效浓度即为低于1.25mg・mL-1，而与该浓度相关的鲎试剂灵敏度应该为λb=0.125EU・mL-1以上，只有这种灵敏度才能够进行下一步的干扰实验。
最后，为了能够让试验结果具有代表性以及典型性，实验人员选择使用不同厂家生产的鲎试剂，因为鲎试剂的生产标准并不统一，所以不同的厂家在生产鲎试剂期间，无论是工艺，还是配方以及参数都有所差异，这些差异导致了其对样品具有不同的抗干扰能力，因此选择使用多个厂家生产的鲎试剂来进行抗干扰试验，获得的结果更加科学合理。本文试验中，选择了多个厂家的生产的鲎试剂，并且选择了3个不同的批号的样品，从试验结果中，能够明显的发现，将这3个不同批次的样品放入到不同生产厂家生产的鲎试剂中，将每个样品都稀释到1.25mg・mL-1，按照我国新世纪初颁布的标准药典，其中规定的做干扰试验时，其最终结果的判断标准，能够表现，当样品正好处于1.25mg・mL-1以及以下时，可以完全放心使用，其不会对细菌内毒素的检查产生任何的干扰。
参考文献
[1] 雒琪，王复馨，李军.复方氯化钠注射液中细菌内毒素的检查方法[J].山东医药工业.2001（03）.
[2] 周卫，王学群.复方乳酸钠注射液细菌内毒素的检测研究[J].镇江医学院学报.2001（01）.
[3] 邓颖，李军.动态比浊法测定替硝唑葡萄糖注射液中细菌内毒素含量[J].中国药师.2002（04）.
[4] 汪玲，王桂平.细菌内毒素的检测方法及其应用概况[J].中国药师.2003（05）.
[5] 刘玉楼，邢素娥.乳酸环丙沙星注射液细菌内毒素检验方法的研究[J].黑龙江医药.2003（03）.