基于细胞色素C氧化酶基因(COI)和核糖体16SrDNA条形码的中药海蛇品种鉴定

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[摘要]海蛇是我国名贵药材之一，新鲜捕捞的海蛇不易保存，一般立刻晒制保存，晒干后海蛇外观变化大，不宜再用外观鉴定，而基因条形码作为一种较新的分子鉴定方法则不再受外观变化困扰，适用于海蛇晒干制品的品种鉴定。该以平颌海蛇Lapemis hardwickii、环纹海蛇Hydrophis fasciatus、尖尾海蛇Aipysurus eydouxii、贝尔切海蛇H belcheri和兰伯特海蛇H lamberti等5种海蛇为研究对象，通过提取实验和基因测序技术测定了这5种海蛇的coi和16S rDNA基因序列，对这些序列进行互相比对并用相似性搜索算法评价5条序列的鉴定成功率。研究显示，16S rDNA基因条形码能初步区分海蛇种属， COI基因条形码序列种内种间差异明显，能进一步区分海蛇品种。因此表明COI序列可以作为海蛇晒干制品的品种鉴定方法。

[关键词]海蛇；品种鉴定；基因条形码；COI；16S rDNA

[Abstract]Hydrophidae， one of the precious traditional Chinese medicines， is generally drily preserved to prevent corruption， but it is hard to identify the species of Hydrophidae through the appearance because of the change due to the drying process The identification through analysis on gene barcode， a new technique in species identification， can avoid this problem The gene barcodes of the 5 species of Hydrophidae， Lapemis hardwickii， Hydrophis fasciatus， Aipysurus eydouxii， Hydrophis belcher and Hydrophis lamberti， were acquired through DNA extraction and gene sequencing These barcodes were then in sequence alignment and test the identification efficiency by BLAST Our results showed that the 16S rDNA sequences identified Hydrophidae briefly and the COI sequenceshad obvious difference between intraand interspecies， indicating that DNA barcoding was an efficiency method of Hydrophidae identification

[Key words]Hydrophidae； species identification； DNA barcode； COI； 16S rDNA

doi：10.4268/cjcmm20161005

海蛇药用最早出现在唐代陈i器的《本草拾遗》，常用于关节疼痛、风湿痹症、疥癣恶疮、四肢麻木等症，具有祛风燥湿、通络活血、滋补强壮和攻毒等功效[1]。海蛇全身入药，本身含不饱和脂肪酸、牛黄胆酸、氨基酸等营养及药用成分，其提取物能明显提高小鼠运动耐力和耐疲劳能力及治疗胶原诱导性关节炎大鼠[2]。海蛇胆具有显著祛痰、止咳作用，对乙酰胆碱造成的气管痉挛有明显缓解作用[3]。药用海蛇来源于海蛇科，全科共50种海蛇，在我国有分布的有15种，包括：平颏海蛇、青环海蛇、长吻海蛇、黑头海蛇、淡灰海蛇、环纹海蛇、半环扁尾海蛇、小头海蛇、青灰海蛇、海蝰、兰灰扁尾海蛇、海蛇、扁尾海蛇、棘眦海蛇、棘鳞蛇等[1]。文献中记载海蛇传统的鉴定方法是通过外观性状进行的鉴定，一般利用蛇头的鳞片样式、蛇身花纹、鳞片大小及行数等特征进行鉴定。但是，这种传统鉴定方法存在着若干问题，主要有：主观因素影响大，依赖于鉴定者的经验；②海蛇药材一般为干品，晒制过程中外观的损坏，给鉴定带来了困难；③对于饮片或粉末，无法适用外观鉴定。而作为新的分子生物学鉴定方法，DNA条形码不受外观性状和主观因素影响，操作简单，对材料无选择性，结果稳定且准确，通用性好，应用广泛。目前，DNA条形码作为一种新的鉴定工具在动物药材鉴定中具有良好的应用前景，国家药典委员会已讨论通过在《中国药典》增补本中列入中药材 DNA 条形码分子鉴定指导原则。相关的研究者对多种的动物药材进行了DNA条形码分子鉴定工作，例如：金钱白花蛇，海马，鳖甲等。但是在我国，统一的动物药材DNA条形码数据库尚未建立，这限制了DNA条形码在动物药材鉴定的进一步应用。本文对海蛇的DNA条形码分子鉴定研究无疑对动物药材DNA条形码分子鉴定进行了补充[4]。

1材料与方法

11样品3批海蛇样品分别购自于广西北海市水产品市场，共25份样品，均产于北部湾海域，见表1。海蛇品种由北京大学药学院屠鹏飞教授鉴定。

12试剂海洋动物基因组DNA提取试剂盒（DP204，北京天根生化技术有限公司）；2×PCR Reagent（KT207，北京天根生化技术有限公司）；无水乙醇（北京化工厂）；TBE buffer（Macgene中国香港）；琼脂糖粉末（BIOWEST 中国香港）；核酸染料（北京鼎国生物技术有限公司）；16S rDNA和COI引物（北京鼎国生物技术有限公司）；琼脂糖凝胶回收试剂盒（DP209，北京天根生化技术有限公司）。