枯草芽孢杆菌B.SUBT12酶学性质浅析

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摘要：考察了分离得到的一株产中性蛋白酶枯草芽孢杆菌b.subt12最适作用温度、pH值以及温度、pH值、金属离子和表面活性剂对酶稳定性的影响。试验研究表明：该酶最适作用温度为55℃，最适作用pH为7.5，酶在55℃反应45min仍有50的酶活力，热稳定性较好。金属Ca2 和表面活性剂Tween-80对酶有一定的激活作用，但激活作用不太明显。关键词:枯草芽孢杆菌；中性蛋白酶；酶学性质；中国分类号:Q925.2文献标码:A中性蛋白酶是一类适合于在中性条件下水解蛋白质肽键的酶类,最早被发现并广泛应用于工业化生产,可用于皮革脱毛、动物血液蛋白酶水解制备复合氨基酸营养液[1]、大豆蛋白水解[2]以及医学治疗[3]等应用领域中。目前国内外有关中性蛋白酶的研究相当的多[1-7]。酶作用条件不是酶的特征性参数,因环境的改变而改变,酶活力不仅受温度、pH的影响,而且还易受到金属离子、表面活性剂等环境因素的影响。因此,本试验着重考察了酶反应体系温度、pH值、金属离子以及表面活性剂对酶作用条件及稳定性的影响,希望通过此研究得到B.SUBT12的最佳反应条件和酶的稳定性,为其应用奠定良好的理论基础。1材料与方法1.1材料1.1.1供试菌种　由课题组分离得到，经初步鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。1.1.2培养基1.1.2.1牛肉膏蛋白胨培养基[8]培养基配方略。1.1.2.2发酵培养基[9]培养基配方略。1.2方法1.2.1菌种鉴定通过观察菌落形态、培养特性及生理生化特性等对B.SUBT12进行鉴定。1.2.2酶活力测定按Folin-酚法[10]1.2.4酶最适作用温度将稀释粗酶液分别于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃不同温度下反应,测定其蛋白酶活力。以温度为横坐标,相对酶活力为纵坐标作图。1.2.5酶最适pH值的研究分别配制pH(3.0～10.5)不同的1的干酪素溶液,按Folin-酚法[10]进行蛋白酶活力测定。以pH为横坐标,以相对酶活力为纵坐标作图。其中pH3.0-5.0由Na2HPO4-柠檬酸缓冲液配制,pH6.0-8.0由磷酸缓冲液配制,pH9.0由硼酸缓冲液配制,pH10.0由硼砂-NaOH缓冲液配制。1.2.6温度对酶稳定性的影响取20ml稀释粗酶液于55℃恒温水浴10min、20min、30min、40min、50min、60min,然后测定其残存酶活力,以时间为横坐标,相对酶活力为纵坐标作图。1.2.7pH对酶热稳定性影响用pH7.5的缓冲液定容1ml粗酶液至100ml,分别取20ml稀释酶液于40℃、50℃、60℃、70℃保温30min,测残余酶活。以温度为横坐标,相对酶活力为纵坐标作图。1.2.8金属离子对酶稳定性的影响在稀释酶液中加入0.1mol/L的不同金属离子,保温30min,测定蛋白酶活力,以金属离子作横坐标,蛋白酶活力作纵坐标作图。1.2.9表面活性剂对酶稳定性的影响在稀释粗酶液中加入不同体积的表面活性剂Tween80(1-5ml),于40℃保温30min,然后测定其蛋白酶活力。以Tween-80添加量作横坐标,酶活力为纵坐标作图。2结果与分析2.1菌种鉴定细胞杆状,成链状排列,端口成圆形,芽孢椭圆或圆形,单芽孢,兼性好氧,能利用葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖和D-甘露糖产酸。葡萄糖产气,最适生长温度35-37℃,5℃和50℃以上无法生长,菌落成乳白色,边缘整齐,表面有皱褶、隆起,菌落表面干燥,G ,菌落不透明,M.R试验、V.P试验、过氧化氢酶试验均为阳性,可利用丙二酸盐。初步鉴定为枯草芽孢杆菌.2.2酶最适作用温度将粗酶液分别于不同温度下反应,测定其蛋白酶活力。结果如图1。从图1可以看出，酶在55℃酶活性最高，在45℃-60℃有较好的稳定性，酶最适作用温度为55℃。2.3酶最适作用pH值将稀释粗酶液于不同pH值的缓冲液体系中反应,然后测定其蛋白酶活力,结果如图2。从图2可以看出,酶在pH7.5缓冲液体系中酶活力最高。因此酶最适pH为7.5。图1酶最适作用温度图2酶最适作用pH值2.4温度对酶稳定性的影响将酶液于55℃保温10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min后,按Folin-酚[9]法测定蛋白酶活力,结果如图3。从图3可以看出,酶的热稳定性较好。在55℃保温45min仍保持有近50活力,当保温时间延长至60min或更长时,酶因热变性活力急剧下降甚至没有了活力。2.5pH对酶热稳定性的影响将1ml酶液用pH7.5缓冲液稀释到100ml并于55℃分别保温40min、50min、60min、70min,然后测定其蛋白酶活力,结果如图4。从图4可以看出,pH对酶有一定的保护作用。在此体系中反应,酶保温60min仍有近50的活力,保温时间继续延长到70min时,酶因热变性酶活急剧降低。如果继续加长酶液的保温时间,酶会因为热变性完全失活。2.6金属离子对酶稳定性的影响在稀释粗酶液中加入0.1mol/L不同的金属离子40℃保温30min,然后按Folin-酚法测定蛋白酶活力,结果如图5。从图5可以看出,Ca2 对酶有一定的激活作用和稳定作用,但激活作用不明显,这与许多相关报道相同[11-13]。Fe3 对酶有强烈的抑制作用,作用机理有待于更一步深究。2.7表面活性剂对酶稳定性的影响向稀释粗酶液中加入不同体积的Tween-80,40℃保温30min,测定其蛋白酶活力。试验结果表明,表面活性剂对酶有不同程度的激活作用(图略)。当添加量为5ml时,酶活达1286.36U/ml,比空白提高了近12.09。可能作用机理为：表面活性剂亲水亲油基团有利于增强细胞膜的通透性,微生物蛋白水解酶均为胞外酶,膜通透性的增强有利于酶从膜内往外运输,也有可能是由于细胞膜通透性的改变打破细胞内酶合成的平衡机制,因此提高了发酵液中蛋白酶的产量。3结论与讨论B.SUBT12经初步鉴定为枯草芽孢杆菌，酶学性质研究表明最适作用温度为55℃，最适作用pH值为7.5，酶的热稳定性较好，pH对酶有一定的保护作用，在pH7.5的反应体系中，酶在55℃保温60min时，酶有50的活力，时间延长至70min时，酶仍有30的活力，缓冲液对酶的“保护”作用可能是由于缓冲液有利于酶三级结构的稳定，因此，温度对其作用效力得到缓和。金属离子对酶有一定的激活作用，但激活作用不太明显，可能是由于“金属桥”的形成有利于酶与底物的结合。表面活性剂对产酶也有激活作用，添加5mlTween80到反应体系中,酶活提高了12.09。参考文献[1]卢寅泉,刘昭明酶技术开发动物血制取复合氨基酸营养液的研究[J]食品科学.1995,16(7).-13-18[2]郑玉锖,李珑大豆分离蛋白酶解过程的研究与产物分析[J]福州大学学报：自然科学版.1996,24(2).-109-113[3]朱建民,张庆宏中性蛋白酶在骨新生中的作用[J]中华骨科杂志.1996,16(8).-519-521[4]杨世平米曲霉中性蛋白酶特性的研究[J]湛江海洋大学学报.20__,04:26~29[5]MoyanChen.Effectsoftemperature,pHandNaClonproteaseactivityindigestivetractofyoungturbot,Scophthalmusmaximus[J].ChineseJournalofOceanologyandLimnology,20__,3:88~94[6]FedericoJ.Wolman,MarianoGrasselli,OsvaldoCascone.Rapidneutralproteasepurificationbydye-affinitymembranechromatography[J]ProcessBiochemistry,20__,1:356-361[7]ChandranSandhya,Alagarsam ySumantha,parativeevaluationofneutralproteaseproductionbyAspergillusoryzaeinsubmergedandsolid-statefermentation[J]ProcessBiochemistry,20__,8:2689-26948赫林食品微生物实验技术[M]北京中国农业出版社20__9肖怀秋林亲录李玉珍赵谋明产中性蛋白酶菌株B4发酵条件的研究[J]食品与机械20__(5):23~25,2810姜锡瑞段钢著新编酶制剂实用技术手册[M]中国轻工出版社20__11薛林贵冯清平紫外诱变原生质选育高产碱性蛋白酶菌株的研究[J]兰州大学学报(自然科学版)1997,32(2):72-7812孙谧修朝阳王跃军等黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶性质鉴定[J]海洋水产研究20__,22(2):1-1013郭杰炎主编微生物酶[M]北京,科学出版社,1986