一株恶臭假单胞菌AD-1的好氧反硝化及产酶特性研究
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Performance Analysis on Aerobic Denitrification and Enzyme Production of a Pseudomonas Putid AD-1
Zhang Guoning；Wu Shihan；Cai Guanglu；Wu Pei
（①Hebei Zhonglian Energy and Environment Sci.&Tech. Co.，Ltd.，Shijiazhuang 050031，China；②Inner Mongolia University of Science & Technology School of Energy and Environment，Baotou 014010，China；③Urban and Rural Construction School of Hebei，Shijiazhuang 050031，China）
摘要： 为更好地实现好氧反硝化菌的脱氮性能，本研究基于前期筛选的一株好氧反硝化菌pseudomonas putida AD-1，从脱氮效率及产酶角度考察其不同CODcr/TN和DO下的反硝化脱氮性能。在一定CODcr/TN范围内，CODcr/TN与培养24h后的菌株脱氮效率及ORP的减少量均呈正相关。当CODcr/TN为20.7时，脱氮效率为59.68%；当CODcr/TN为2.1时，脱氮效率仅为7.53%。培养过程中NO2-N浓度虽始终处于较低水平却呈上下波动状态。AD-1菌的ODO在4.82 mg/L 左右，与大多数的好氧反硝化菌相比具有更高的氧气忍受浓度。通过SDS-PAGE蛋白电泳可以明显看出不同DO下菌体与反硝化相关的蛋白表达差异性，为进一步研究好氧反硝化菌产酶特性奠定理论基础。
Abstract： To achieve a better nitrogen removal performance of aerobic denitrifiers, the study investigated its denitrification activity under different CODcr/TN ratios and DO concentration at the angle of nitrogen removal rate and enzyme production based on an our previous screening an aerobic denitrifier Pseudomonas putida AD-1. Results indicated that, at a certain range of CODcr/TN ratios, the CODcr/TN ratios were positively correlated well with denitrification efficiency and ORP reduction after 24h cultivation. When CODcr/TN ratios were 20.7 and 2.1, denitrification efficiency were 59.68% and 7.53%, respectively. It was interesting that nitrite concentration was always at low level but fluctuated during the culturing process. The optimal DO concentration of AD-1 was approximate 4.82mg/L which demonstrated AD-1 could tolerate higher DO concentration than most aerobic denitrifiers. By SDS-PAGE difference analysis on the protein expression under different DO concentration laid a theoretical foundation for further study on enzymatic characteristic of aerobic denitrifiers.
关键词： 好氧反硝化菌AD-1 碳氮比 溶解氧 硝酸盐还原酶系 亚硝酸盐还原酶系
Key words： Aerobic denitrifier AD-1; CODcr/TN ratio; DO; Nitrate reductase; Nitrite reductase
中图分类号：G31 文献标识码：A文章编号：1006-4311（2011）14-0313-03
0引言
传统生物脱氮在无分子氧的条件下以有机物作为碳源，NO■■/NO■■作为能量代谢中的电子受体，O2-作为氢受体，合成自身物质或生成N2和H2O，进而达到脱氮的目的。反硝化菌如Achromobacter, Aerobacter, Bacillus, Brevibacterium, Flavobacterium, Lactobacillus和Pseudomonas[1]等在缺氧或厌氧条件下反硝化基因得到表达，具有一定的反硝化脱氮性能。但是厌氧反硝化菌株代谢缓慢，而且好氧菌与厌氧菌的空间分离培养也增加了脱氮工艺的成本[2，3]。而好氧反硝化菌(Aerobic Denitrifier, AD)及其好氧反硝化酶系的研究极大推进了生物脱氮技术的进程，受到国内外学者的广泛关注[4，5]。AD可以在有氧条件下以有机物为电子供体，并且同时以O2和NO■■/NO■■为电子受体，产生氮气。AD实现了同一空间内的同步硝化-反硝化，避免了系统运行过程中pH的调节，节约了污水处理系统运行成本，克服了厌氧反硝化菌生长缓慢，脱氮效率低的缺点[10，11]，为高浓度含氮废水的处理提供了一条新途径。影响好氧反硝化菌脱氮效率的主要因素是CODcr/TN和DO。由于AD属于异养微生物，脱氮过程伴随着有机物的消耗，较低的CODcr/TN会降低ATP的合成，从而抑制电子传递链中电子传递。氧气作为AD脱氮过程中的电子受体，在电子传递链中起关键作用。研究表明，大多数好氧反硝化菌在DO高于3mg/L时反硝化作用受到抑制[4，9]。所以对于满足好氧反硝化所需的最适溶氧浓度(Optimal DO, ODO) 研究具有重要意义。
以前大量的研究仅仅集中于好氧反硝化菌的性能评价，对硝酸盐/亚硝酸盐还原酶系产生的动态变化以及与菌株脱氮效率的关系研究关注较少。本研究基于某大学微生物实验室前期自连续化好氧-厌氧耦合(Continuous Aerobic-anaerobic Coupled, CAAC)反应器[12]中筛选出的1株高效好氧反硝化菌Pseudomonas Putid AD-1，考察该菌在不同CODcr/TN、DO下的ORP及脱氮效率变化，并初步探索硝酸盐/亚硝酸盐还原酶系与脱氮效率间的关系。
1材料与方法
1.1 培养基①SM培养基（/L）：柠檬酸钠8.5g，NaNO3 0.85g，KH2PO4 1.36g，（NH4）2SO4 0.27g，Yeast extract 1g，MgSO4・7H2O 0.19g；②溴百里酚蓝（BTB）培养基（/L）[13]：L-天冬酰胺 1g，NaNO3 1g，KH2PO4 1g，FeCl2・7H2O 0.05g，CaCl2・2H2O 0.2g，Mg2SO4・7H2O 1g，BTB(1%溶于酒精) 1mL，琼脂20g，pH 7.0～7.3；③LB液体培养基（/L）：Yeast extract 5g，蛋白胨10g，NaCl 10g；④DM培养基（/L）：KNO3 0.6g，KH2PO4 1g，MgSO4・7H2O 1g，柠檬酸钠 9.63g。
1.2 菌株来源恶臭假单胞菌ad-1筛选自某大学微生物实验室处理大豆乳清废水厌氧出水的CAAC反应器。
1.3 实验方法
1.3.1 不同CODcr/N下的脱氮性能及ORP测定挑取已保存菌落接种至50mL LB液体培养基中，30℃，170rpm振荡培养14h。取4mL已调整至相同OD的菌悬液4mL接种于CODcr/TN分别为2.1，4.4，8.3，10.1，20.7的100mL DM液体培养基中30℃，170rpm振荡培养，每12h进行反硝化性能测定。CODcr/TN通过维持恒定KNO3量而调整柠檬酸钠量调节。
1.3.2 不同DO下的脱氮性能测定及菌体蛋白表达差异比较
通过摇床转速实现不同DO梯度下的AD-1菌脱氮性能，调整DO分别为1.55mg/L，4.82mg/L，7.73mg/L，每12h进行反硝化性能测定。收集不同DO下菌体，沸水浴10min，破碎菌体并使蛋白变性后进行SDS-PAGE电泳，采用30％的分离胶、5％的浓缩胶[14]。电泳后胶板采用考马斯亮蓝R-250染色，经BIO-RAD GelDoe凝胶成像系统拍照分析。
1.4 分析方法主要指标分析方法[15]：CODcr采用快速消解分光光度法测定；TN采用GB 11894-89碱性过硫酸钾紫外分光光度计法测定；NH4-N采用氨敏电极法测定；DO采用上海精密科学仪器有限公司JPBJ-608型DO测定仪测定；硝态氮采用GB 7480-87酚二磺酸紫外分光光度法测定；亚硝态氮测定采用GB 7493-87 N-(1-奈基)-乙二胺分光光度法。
2结果与讨论
2.1 批次培养过程中AD-1菌不同CODcr/TN下的脱氮性能及ORP变化情况考察了不同CODcr/TN下的NO■■N的变化情况及CODcr/TN与TN去除率的关系（如图1和图2所示）。当CODcr/TN为2.1时，NO■■N去除率极低，小于7.65%。随着CODcr/TN的不断提高，NO■■N的去除效率逐渐升高，当CODcr/TN为20.7时NO■■N的去除率在24h时达到最高，约59.68%（图1）。而随着时间延长NO3-N的去除率降低的原因可能与批次实验中后期碳源不足有关。CODcr/TN与24h时的TN去除率呈显著的正相关（R2=0.9991），如图2所示，这与Patureau等[16]研究的在一定氮素负荷下，硝酸盐还原速度与COD负荷成正比的结果相吻合。结果不仅证实了反硝化作用需要有机物作为电子供体提供能量，而且高CODcr/TN有利于反硝化脱氮进行。
图3考察了不同CODcr/TN下的NO■■N的变化情况。在低CODcr/TN为2.1与4.4时，NO■■N浓度为0~0.1mg/L，处于极低水平。随着CODcr/TN不断增加，NO■■N浓度增大，12h时的NO■■N浓度与CODcr/TN成正相关，表明CODcr/TN对硝酸盐与亚硝酸盐还原酶系产生量的影响。同时，NO■■N浓度呈高低波动变化，推测在一定的碳源浓度条件下亚硝酸盐还原酶系的产生需要亚硝酸盐的诱导。当亚硝酸盐浓度较低时，亚硝酸盐还原酶系分泌较少，导致亚硝酸盐浓度上升；当NO■■N积累到一定程度时亚硝酸盐还原酶系被诱导加速分泌，进而导致NO■■N浓度下降。
图4、图5考察了不同CODcr/TN下的ORP变化情况及其与ORP的关系。可以看出ORP的变化趋势与NO3-N浓度的变化趋势相似，即CODcr/TN越高，ORP越低，CODcr/TN与24h时的ORP的减少量呈正相关(R2=0.96838)。原因是由于氮元素从高价态NO3-N被还原为低价态，氧化势下降。而48h后ORP再次下降可能与后期碳源减少、菌体代谢活性降低有关。
2.2 批次培养过程中AD-1菌不同DO下的脱氮性能分析为了考察不同DO对AD-1菌脱氮性能的影响，选择3个DO梯度进行测定。如图6、7所示。AD-1菌在DO为4.82mg/L时硝态氮去除效率最高为63.35%，分别高于DO 为1.55mg/L时的38.99%与7.73mg/L时的57.60%。结果表明AD-1菌的ODO在4.82mg/L 左右，高于大多数好氧反硝化菌的3mg/L，DO过高或过低都会抑制其反硝化效率，所以AD-1菌与大多数的好氧反硝化菌相比具有更高的氧气忍受浓度。
2.3 不同DO下的菌体蛋白表达差异性分析通过SDS-PAGE电泳考察不同DO下菌体的蛋白表达差异性，如图所示。可以看出a和b两条特征条带蛋白量在不同DO下的变化趋势与反硝化效率成正相关，即DO为4.82mg/L时蛋白表达量最高，DO为7.73mg/L时居其次，蛋白量最少的是DO为1.55mg/L时，推测a和b两种蛋白与反硝化酶系相关。
由于污水处理系统中的微生物种群间存在复杂的互生、共生及竞争关系，而且批次培养过程中碳源的逐渐减少会抑制反硝化作用，所以为了更好地研究AD-1菌株在污水处理过程中的贡献，需要将AD-1菌投加到处理污水的微生物群落中同时进行连续或半连续进水进一步考察其工程应用价值。
3结论
①CODcr/TN是Pseudomonas Putid AD-1菌株实现反硝化脱氮作用关键限速因素之一。在一定的时间和CODcr/TN范围内，CODcr/TN与AD-1菌脱氮效率和ORP的减少量均成正相关，即高CODcr/TN促进脱氮，低CODcr/TN限制脱氮。②Pseudomonas Putid AD-1的ODO在4.82mg/L 左右，具有较高的氧气忍受浓度。③不同DO下Pseudomonas Putid AD-1蛋白表达量的变化具有与脱氮性能差异相似的规律性。
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