固相萃取高效液相色谱法测定蛋和肉中的三聚氰胺

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摘要：建立快速灵敏的测定蛋和肉中三聚氰胺的高效液相色谱分析方法。考察了样品中三聚氰胺在酸性和碱性条件下水解的稳定性。试验选用强碱水解样品，采用强阳离子固相萃取柱萃取，高效液相色谱分析。工作曲线线性范围超过0.4～10ug/mL，三聚氰胺检测限为0.06ug/mL(S/N=3)，相对标准偏差都小于2%（n=5），平均回收率分别在93%-97%。建立的方法适用于蛋和肉中三聚氰胺的定量定性分析。

关键词：三聚氰胺 固相微萃取 高效液相色谱

继2007年3月美国召回大量被三聚氰胺的饲料，三聚氰胺成为社会热点话题[1，2]，在我国2008年9月三聚氰胺再次成人们关注的热点，多数国内知名品牌奶粉发现被三聚氰胺污染。国家立刻采取相应措施，在2008年10月初出台了原料乳和乳制品中三聚氰胺检测国家标准。对于食品和饲料中三聚氰胺检测研究主要集中于近年[3-4]，一些不法分子利用现行蛋白含量分析的漏洞，为了提高饲料和食品检出含量而向其中恶意添三聚氰胺，在国外都造成了恶劣影响。三聚氰胺的分析方法主要为高效液相色谱法[5]、液相色谱质谱法[6]和液相色谱-串联质谱法[7]，其中以高效液相色谱法最为简单经济。如今以出台饲料和乳制品中的三聚氰胺检测的国家标准，还未有关于蛋和肉制品中的三聚氰胺检测方法的报道。依据当前形势，建立蛋和肉制品中的三聚氰胺检测方法迫在眉睫。本文采用固相萃取/液相色谱法快速检测蛋和肉制品中的三聚氰胺，方法分析速度快、灵敏度高，适用于蛋和肉中三聚氰胺的定量定性分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

岛津高效液相色谱仪，配10ATVP输送泵，SPD-10A检测器(日本，岛津公司)。混合型阳离子交换同相萃取柱（strata-X-C, 60mg/3ml,菲罗门公司）；

三聚氰胺：分析纯，纯度不低于99.5%；其余化学试剂均为国产分析纯。

三聚氰胺标准储备液：精确称取三聚氰胺20mg，40%定容至100ml，制得200μg/ml标准储备液。

1.2 色谱条件

色谱柱：Luna5uC8(2)100A（250×4.6mm）；检测波长240nm，柱温：常温；流动相：缓冲液：乙腈=85:15；缓冲液：10mmol/L柠檬酸，10mmol/L庚烷磺酸钠；流速：1.0mL/min；进样量：10μL。

1.3 样品处理

称取搅匀样品5g于100ml容量瓶中，依次加入6mol/L氢氧化钠或盐酸2mL样品，水域60℃水解3h，水解液调pH至3左右，用10g/L三氯乙酸溶液定容至刻度后过滤，取滤液2ml上分别用3ml水和3ml甲醇活化后的强阳离子固相提取柱，控制流速，大约1ml/min，分别使用3ml甲醇和3ml水淋洗后，用3ml5%的氨水-甲醇（V/V）洗脱，洗脱液收集与10ml离心试管。50℃下用N2吹干后，加流动相2ml，涡旋震荡1min，过0.2μm有机滤膜，进样10μl经HPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 三聚氰胺在强酸和强碱条件下稳定性考察

为了充分提取蛋和肉样品中的三聚氰胺，需要对样品进行水解。水解方式一般有碱水解、酸水解和酶水解。酶水解虽然条件温和、对分析物破坏程度小，但成本偏高，故而在可以使用碱水解、酸水解是不使用酶水解。试验考察了在6M氢氧化钠和6M盐酸的强碱、强酸条件下，60℃加热3小时的稳定性。分别称取搅匀的三聚氰胺阴性鲜鸡蛋5g于15只100ml容量瓶中，分别加入200μg/ml三聚氰胺标液5ml，其中5只加三氯乙酸溶液超声提取，5只加6M氢氧化钠溶液2ml，5只加6M盐酸溶液2ml于60℃水浴加热3小时。三组试验的回收率见图1，样品平均加标回收率为：不水解为95.4、酸水解为96.8%、碱水解为97.6%。试验说明三聚氰胺在强碱和强酸条件下稳定，分析含三聚氰胺的样品时可以使用强碱或强酸进行水解。本试验选用碱水解。

2.2 方法分析特性

使用200μg/mL储备液，制得标准系列浓度为：0.4、0.8、2.0、4.0、10.0μg/mL。经HPLC分析（标准溶液色谱图见图2），以面积为纵坐标，分析物浓度为横坐标，得标准曲线。曲线方程为：y=8558.6x+2430.7（r=0.9997）。三聚氰胺的检测限为0.063μg/mL（S/N=3），用所配标准溶液测定方法的重复性，选用1μg/mL、4μg/mL和10μg/m标准溶液计算回收率，平均回收率均分别为93.8%（RSD=0.89%）、95.0%（RSD=1.9%）和96.8%（RSD=0.86%），说明此方法满足实际分析要求。

2.3 讨论

试验中发现经过碱水解或酸水解后，样品的加标回收率要高于普通的加标回收率，其中以碱水解样品的加标回收率最高，可能是因为在萃取前要调节pH值，使得溶液中离子强度增强，起到了盐析作用，在调节pH至酸性时，碱水解样品的离子强度最高。

对于鲜蛋样品的分析，可以不必对样品进行水解，可以直接加入三氯乙酸溶液，超声震荡15min后，加入5ml乙酸锌沉淀剂后用三氯乙酸溶液定容、过滤后直接上强阳离子交换柱，可以大大缩短样品的分析时间。

参考文献：

[1]侯艳丽，张惠茹，刘来亭等.三聚氰胺的检测方法[J].饲草饲料，2007，28(29):32-33.

[2]张俊燕，何吕兴.三聚氰胺的样品前处理及最新检测方法[J].生命科学仪器，2007，5：57-59.

[3]Roberto Mu?觡iz-Valencia，Silvia G. Ceballos-Maga?觡a， Daniel Rosales-Martinez，et al. Method development and validation for melamineand and its derivatives in rice concentrates by liquid chromatography. Application to animal feed samples [J].Anal Bioanal Chem，2008，392:523-531.

[4]丁涛，徐锦忠，李健忠等.高效液相色谱-二极管阵列检测法及高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定植物源性蛋白中残留的三聚氰胺[J].色谱，2008，26(1):6-9.

[5]Shin Ono，Tatsuo Funato，Yasuhiko Inoue，et al. Determination of melamine derivatives，melame，meleme，ammeline and ammelide by high-performance cation-exchange chroma

tography [J].Journal of Chromatography A，1998，815:197-204.

[6]黄芳，黄晓兰，吴惠勤等.高效液相色谱-质谱法对饲料及食品添加剂中三聚氰胺的测定[J].分析测试学报，2008，27(3): 313-315.

[7]刘梅，李金强，田德金等.固相萃取-液相色谱-串联质谱法检测食品中的三聚氰胺[J].化学分析计量，2008，17(2):48-50.