洋姜发酵产物对糖类测定的影响
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本文作者：李莉莉王复兴王义鹏秦松作者单位：中国科学院烟台海岸带研究所
菊芋是一种多年生草本植物，俗称洋姜、鬼子姜。菊芋抗盐、旱、寒等能力使它具有较强的生态适应能力，可以在荒山野岭、盐碱滩涂等非耕地种植的特性使其成为一种极具开发潜力的半野生资源。菊芋生物量极大，地下块茎每公顷高达90t[1]。同时块茎干物质中70%以上都是菊粉，该多聚果糖可以在酶的作用下分解而产生大量的果糖和少量的葡萄糖，为生物基化学品的生产提供了良好的碳源。此外，菊芋块茎除含菊粉外，还含有一定数量的蛋白质、脂肪、纤维素、果胶及微量元素等营养成分[2]，这些物质的存在不但使菊芋块茎具有较高的营养价值，也为其在工业应用中提供了养分。相比于咸菜腌制及动物饲料等低附加值的应用，作为能源作物的菊芋，能够被微生物发酵得到高附加值的生物基化学品如燃料乙醇、丁酸等的各类生物基化学品[3-6]。而菊芋发酵过程中总糖含量的测定对发酵过程的评价具有重要的意义。建立菊芋发酵过程中总糖的测定方法是监控菊芋发酵过程的必要步骤之一，同时发酵过程中的主要代谢物可能对糖类的测定有一定的影响。本实验首先建立了一种稳定的总糖测定方法，其次考察了乙醇、丁酸、乳酸、1,4-丁二醇等代谢物对总糖测定的影响。
1材料与方法
1.1材料与仪器
硫酸、蒽酮、硫脲、乙醇、丁酸、乳酸、1,4-丁二醇、葡萄糖：AR级；菊粉wedin-P97：菊粉含量≥97，青海威德生物技术有限公司。TU-1901双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；CP214电子天平：奥豪斯仪器有限公司。
1.2实验方法
1.2.1溶液的配制
配制0.1g/L的葡萄糖标准液和0.1g/L的菊粉标准液。
1.2.2糖-蒽酮反应及吸光度的测定
将待测样品放于具塞试管后，将具塞管置于冰浴中，加入蒽酮溶液4mL，混匀，沸水浴加热反应(反应时间为后面结果得到的最佳反应时间12min)，流水冷却，室温放置10min，用紫外分光光度计于最大吸收波长处(620nm)测定吸光度。每个样品均为3个平行样，吸光度为3个样品的平均值。
1.2.3最大吸收波长的选择
取1mL葡萄糖标准液于具塞管中。蒽酮反应后用紫外分光光度计于450~800nm进行吸光度的扫描。
1.2.4总糖-蒽酮反应时间的确定
取1mL葡萄糖标准液于具塞管中。其中沸水浴的反应时间选择为3、5、7、8、10、12、14min。
1.2.5葡萄糖标准曲线的绘制
取0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0mL葡萄糖标准液于具塞管中，分别用移液器补水至1mL。
1.2.6稳定性试验
取0.5mL葡萄糖标准液于具塞管中，用移液器补水至1mL。与蒽酮反应完毕，流水冷却放置0、0.25、1.25、2.25、2.75、3.25、3.75h时分别测定吸光度。
1.2.7回收率实验
取0.25mL葡萄糖标准液和0.25mL菊粉标准液于具塞管中，分别用移液器补水至1mL；对照样加蒸馏水1mL。1.2.8乙醇、丁酸、乳酸、1,4-丁二醇对总糖测定的影响配置含乙醇(或丁酸、乳酸、1,4-丁二醇)0、2%、6%、10%(v/v)的0.05g/L的菊粉溶液，取1mL放于具塞试管中。每个样品重复3管。配制含乳酸(或1,4-丁二醇)0、2%、6%、10%(v/v)的溶液，取1mL放于具塞试管中。每个样品重复3管。
2结果与讨论
2.1最大吸收波长的选择
用分光光度计在450~800nm波长下对菊粉溶液进行扫描，由图1可知，菊粉最大吸收波长为620nm。本最大吸收波长与以前报道的波长是一致的[7]，说明本物质的最大吸收波长是非常稳定的，总糖测定波长选择620nm。
2.2糖与蒽酮反应时间的确定
对糖-蒽酮的反应时间进行考察发现，反应时间3、5、7、8、10、12min时吸光度逐渐增加(图2)，而反应12min时吸光度开始降低，故选择12min作为两者的最佳反应时间。反应容器及反应体积的差异会导致最佳反应时间的差异，总糖测定之前需要依照本身的实验容器和体系确定最佳反应时间。
2.3葡萄糖标准曲线的绘制
葡萄糖标准曲线的回归方程为：A=0.0278x-0.0047(其中x为葡萄糖浓度μg/mL)，回归系数：R2=0.9998，在0~20μg/mL范围内线性关系良好，可用于糖含量的测定。
2.4稳定性实验
分别在0、0.25、1.25、2.25、2.75、3.25、3.75h于621nm处测样品的吸光度。结果显示RSD为1.80%，表明在3.75h内吸光度无明显变化，显色稳定。
2.5回收率实验
在已知含量的菊粉样品中分别加入一定量的葡萄糖标准品，测定吸光度，计算回收率，其平均值为100.2%，RSD=4.25%。
2.6乙醇、丁酸对糖类测定的影响
由表1可知，含乙醇2%~10%的菊粉溶液与不含乙醇的菊粉对照样相比吸光度变化不大，同时表2的t检验结果显示P值均大于0.05，含乙醇的菊粉液与无乙醇的对照样相比吸光度无显著性差异，结果表明菊粉溶液中乙醇含量小于10%时对总糖含量的测定无影响。丁酸的结果与乙醇的类似，吸光度(表1)与t检验(表2)的结果显示，菊粉溶液中丁酸含量小于10%时对总糖含量的测定无影响。
2.7乳酸、1,4-丁二醇对糖类测定的影响
由表3可知，含乳酸2%~10%的菊粉溶液与不含乳酸的菊粉对照样相比吸光度差异很大，同时表4的t检验结果显示P值均小于0.01，即含乳酸的菊粉溶液与无乳酸的对照样相比吸光度差异极显著，结果表明乳酸对菊粉溶液总糖含量的影响很大。1,4-丁二醇的结果与乳酸的类似，吸光度(表3)与t检验(表4)的结果显示，1,4-丁二醇对菊粉溶液总糖含量的影响很大。为了进一步考察乳酸和1,4-丁二醇对总糖测定影响的规律，对无菊粉添加的不同浓度的乳酸和1,4-丁二醇溶液经过硫酸-蒽酮反应对其吸光度进行测定，结果见表5。无菊粉的乳酸蒽酮反应的吸光度结果显示(表5)，含乳酸的菊粉溶液的吸光度≈菊粉蒽酮反应后的吸光度+乳酸蒽酮反应后的吸光度；以含2%的乳酸菊粉溶液为例，无乳酸的菊粉蒽酮反应后的吸光度为0.332(表3)，2%乳酸蒽酮反应后的吸光度为0.555(表3)，两者之和为0.886，而含2%乳酸的菊粉溶液蒽酮反应后的吸光度为0.868(表5)。对含2%、6%、10%乳酸的菊粉溶液蒽酮反应后的吸光度和菊粉蒽酮反应后的吸光度与乳酸蒽酮反应后的吸光度之和的t检验分析显示，P值为0.937＞0.05，故两者无显著性差异，所以我们认为含乳酸的菊粉溶液蒽酮反应后的吸光度=菊粉蒽酮反应后的吸光度+乳酸蒽酮反应后的吸光度。上述乳酸影响总糖测定的规律同样适用于1,4-丁二醇，以含2%的1,4-丁二醇菊粉溶液为例，无1,4-丁二醇的菊粉蒽酮反应后的吸光度为0.327(表3)，2%1,4-丁二醇蒽酮反应后的吸光度为0.018(表3)，两者之和为0.345，而含2%1,4-丁二醇的菊粉溶液蒽酮反应后的吸光度为0.338(表5)。对含2%、6%、10%1,4-丁二醇的菊粉溶液蒽酮反应后的吸光度和菊粉蒽酮反应后的吸光度与1,4-丁二醇蒽酮反应后的吸光度之和的t检验分析显示，P值为0.131＞0.05，故两者无显著性差异。所以我们认为含1,4-丁二醇的菊粉溶液蒽酮反应后的吸光度=菊粉蒽酮反应后的吸光度+1,4-丁二醇蒽酮反应后的吸光度。为何乙醇和丁酸对总糖测定无影响，而乳酸和1,4-丁二醇对总糖测定的影响非常大呢？推测应该是后两者在浓硫酸的作用下，可经脱水反应进一步与蒽酮反应产生蓝绿色的衍生物而贡献了部分吸光度。此外，实验中只是列举了菊芋代谢产生的几种典型代谢物对总糖测定的影响，菊芋还能发酵产生2,3-丁二醇[8]、丁二酸[9]、油脂类[10]等一些生物基化学品，在进行总糖测定时首先应先排除自身的代谢物对测定的干扰。
3结论
采用蒽酮-硫酸法对总糖进行测定，测得最大吸收波长为620nm。糖-蒽酮的最佳反应比例为1:4，最佳反应时间为12min。葡萄糖在0~20μg/mL范围内线性关系良好。结果表明，建立的总糖测定方法具有良好的稳定性和回收率，适合对菊芋总糖进行监测。此外，乙醇和丁酸(小于10%，v/v)对总糖的测定无影响，但乳酸和1,4-丁二醇(小于10%，v/v)对总糖测定结果影响很大，且规律为含一定浓度乳酸或1,4-丁二醇的菊粉溶液蒽酮反应后的吸光度为菊粉溶液蒽酮反应后的吸光度与等浓度乳酸或1,4-丁二醇溶液蒽酮反应后的吸光度之和。建立菊芋发酵过程中总糖的测定方法对于监控菊芋发酵过程、测定代谢速率是必要的，同时发酵过程中的主要代谢物可能对糖类的测定有一定的影响，所以测定总糖之前应先排除其他物质对于总糖测定的影响，以保证总糖测定准确性。